2.2.3 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用

DCF的熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。如圖5所示，對(duì)照組熒光強(qiáng)度最低，即細(xì)胞內(nèi)ROS含量最低，而損傷組細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增加，表明由于H₂O₂對(duì)細(xì)胞的損傷作用，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加。而經(jīng)過消化產(chǎn)物預(yù)先處理的試驗(yàn)組，除低質(zhì)量濃度（0.01mg/mL）的體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（3～10ku）外，均與損傷組存在顯著性差異（P＜0.05），表明消化產(chǎn)物能夠減少細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)生的過量ROS。值得注意的是，ROS含量在低質(zhì)量濃度（0.01mg/mL）和中質(zhì)量濃度（0.1mg/mL）組表現(xiàn)出濃度依賴性，而在中質(zhì)量濃度（0.1mg/mL）和高質(zhì)量濃度（1mg/mL）組沒有表現(xiàn)出由于濃度產(chǎn)生的差異。研究表明，蛋白或肽段可能是由于刺激了細(xì)胞內(nèi)與抗氧化相關(guān)的信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗氧化作用。那么，消化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除在中、高濃度組無差異的原因可能是：一方面，由于肽被細(xì)胞吸收的量達(dá)到飽和；另一方面，由于通路蛋白受體飽和。如圖5所示，0.1mg/mL的體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組無顯著性差異，說明其已經(jīng)能將氧化損傷的Ca-co-2細(xì)胞內(nèi)的ROS清除到接近正常水平，具有較強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化活性。

2.3 體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）肽序列鑒定

從消化產(chǎn)物中抗氧化活性最強(qiáng)的組分中鑒定出3條肽序列，二級(jí)質(zhì)譜圖如圖6所示。利用電噴霧軌道阱對(duì)掃描離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（Colli-sion-InducedDissociation，CID），在低能CID下（10～200eV），多肽鏈只在酰胺鍵處發(fā)生斷裂，因此主要產(chǎn)生b離子和y離子碎片。采用文獻(xiàn)中報(bào)道的從頭測(cè)序的方法，對(duì)多肽序列進(jìn)行鑒定，得到3條四肽，分別為CFDV、CVSP和MPFR，通過與已知卵白蛋白氨基酸序列對(duì)比，這3條肽分別位于卵白蛋白12～15、383～386和197～200氨基酸殘基。
 

2.4 合成肽的體外抗氧化活性

2.4.1 ABTS⁺·清除能力測(cè)定

3種合成肽的ABTS自由基清除活性如圖7所示。CFDV和CVSP表現(xiàn)出明顯的ABTS自由基清除能力，并且具有濃度依賴性。與之相比，MPFR則沒有明顯的ABTS自由基清除能力，自由基清除率不足5%。與混合組分體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）相比，CFDV和CVSP在較低質(zhì)量濃度范圍（0.5，1，5和10μg/mL）就能表現(xiàn)混合組分相當(dāng)?shù)腁BTS自由基清除能力，在質(zhì)量濃度為10μg/mL時(shí)，這兩種肽的ABTS自由基清除活性已經(jīng)接近100%，說明這兩種合成肽的ABTS自由基清除能力高于混合組分體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）。研究表明，多肽的抗氧化活性與氨基酸組成有關(guān)，CFDV和CVSP的強(qiáng)ABTS⁺·清除能力可能與肽鏈N端的半胱氨酸（C）有關(guān)，半胱氨酸含有的硫醇基能直接與自由基反應(yīng)，從而增強(qiáng)了其清除自由基的能力。

2.4.2 ORAC測(cè)定

合成的3種純肽的氧自由基吸收能力結(jié)果如圖8所示。不同于ABTS自由基清除活性，3種合成肽均表現(xiàn)出較強(qiáng)的氧自由基吸收能力，10μg/mL的CFDV、CVSP和MPFR的ORAC值分別為1.87，1.28和1.57μg/mLTE/μg/mL，均高于同濃度的Trolox（1μg/mLTE/μg/mL），說明，3個(gè)多肽的體外抗氧化能力較強(qiáng)，這與多肽中含有Phe（F）、Val（V）以及Met（M）等疏水性氨基酸有關(guān)。其中，MPFR無明顯的ABTS自由基清除能力，但是具有較強(qiáng)的ORAC活性，這是由于這兩種測(cè)定體外抗氧化活性的方法原理的差異導(dǎo)致。

3 結(jié)論

本文研究了經(jīng)體外模擬胃腸道消化的卵白蛋白產(chǎn)物的抗氧化性。發(fā)現(xiàn)體外模擬胃腸道消化能夠提高卵白蛋白ABTS⁺·清除活性和ORAC值，并且組分分子質(zhì)量越小，其抗氧化性越強(qiáng)；分子質(zhì)量＜1ku的產(chǎn)物對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用；3種組分均對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS具有清除作用，并且具有濃度依賴性。從抗氧化活性最強(qiáng)的組分（分子質(zhì)量＜1ku的產(chǎn)物）鑒定出3條四肽序列，結(jié)果顯示CFDV和CVSP表現(xiàn)出明顯的ABTS⁺·清除能力，并且具有濃度依賴性；CFDV、CVSP和MPFR均表現(xiàn)出較強(qiáng)的氧自由基吸收能力。以上結(jié)果顯示，體外模擬胃腸道消化對(duì)卵白蛋白抗氧化活性的提高以及抗氧化活性肽段的釋放具有積極作用，卵白蛋白經(jīng)體內(nèi)消化后抗氧化活性變化規(guī)律及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

相關(guān)鏈接：氨基酸，半胱氨酸，胱氨酸

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