羅望子（TamarindusindicaL.），又名酸角，屬豆科，是一種高大常綠喬木，多見于我國西南省份且多呈半野生狀態(tài)。羅望子的營養(yǎng)價值豐富，其種皮富含單寧、色素；果肉富含多糖、有機酸等營養(yǎng)成分；種仁則以蛋白質(zhì)、多糖及脂肪等為主要成分，其中多糖約占種仁的60%，常作為增稠劑和穩(wěn)定劑應用在食品、飲料及煙草工業(yè)上，而對于提取多糖后殘渣的綜合利用研究甚少。探究羅望子種仁多糖提取后殘渣的營養(yǎng)成分并對其進行綜合利用，從而實現(xiàn)種仁產(chǎn)業(yè)鏈的延長刻不容緩。

Reddy等研究表明提取多糖后的羅望子種仁殘渣中仍含有豐富的蛋白質(zhì)，在印度、蘇丹等酸角主產(chǎn)國常被開發(fā)成飼料。我國雖然盛產(chǎn)羅望子，然而對其科學研究起步較晚且由于提取種仁多糖后的殘渣部分含有黏稠性的不易加工的殘余多糖，因而在工業(yè)上常當作廢料處理，這不僅污染環(huán)境，而且資源大量浪費。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能息息相關，其氨基酸構(gòu)成、分子質(zhì)量的大小、形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)等因素對蛋白質(zhì)的功能和理化性質(zhì)均有較大的影響，如蛋白質(zhì)的肽鍵及氨基酸側(cè)鏈能夠顯著影響其溶解性，而其乳化性質(zhì)受到自身分子大小及表面親疏水性等因素的影響。自上世紀70年代以來，眾多學者相繼測定了羅望子種仁的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)羅望子種仁中蛋白含量高達19.4%，且以種仁球蛋白（Tamarindseedglobulin，TSG）和白蛋白為主，TSG中含有18種氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸含量較高。此外，TSG的氨基酸種類齊全，評分較高，必需氨基酸指數(shù)為71.5，除蘇氨酸和酪氨酸外其它6種必需氨基酸俱全，尤以賴氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸最為豐富。上述研究證實羅望子種仁蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，具有較強的開發(fā)價值。目前對于羅望子種仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能特性及其構(gòu)效關系尚未見研究報道。本文以羅望子種仁提取多糖后的殘渣為原料，提取羅望子種仁球蛋白，通過電泳、巰基二硫鍵含量及氨基酸組成等分析指標對其蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，并測定其溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性，研究其構(gòu)效關系，為日后TSG的功能注釋及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅望子種仁提取多糖后殘渣，來自云南貓哆哩集團食品有限責任公司；大豆分離蛋白，購于山松生物制品有限公司；九三非轉(zhuǎn)基因一級大豆油，購于九三糧油工業(yè)集團有限公司。檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純），購于哈爾濱市化工試劑廠；SDS、TEMED、丙烯酰胺、甲醇、冰醋酸、亞甲基雙丙烯酰胺（均為分析純），購于天津市志遠化學試劑有限公司；葡聚糖凝膠SephadexG-50，購于Summus公司；考馬斯亮藍R-250（分析純），購于天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

FW-135粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-4A離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；722紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DYY-7C垂直電泳儀，北京市六一儀器廠；ThermoUltiMate3000高效液相色譜儀，上海硅儀生化科技有限公司；FJ300高速均質(zhì)乳化機，上海滬析實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羅望子種仁蛋白的提取

羅望子種仁提取多糖后的殘渣中殘留多糖含量為（0.86±0.45）%，采用超聲輔助堿溶酸沉法從殘渣中提取TSG，將去除多糖的沉淀與pH7.4的Tris-HCl緩沖液混合配置為質(zhì)量濃度為25g/L的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為12.5，使用恒溫磁力攪拌器于65℃下攪拌1.5h后放入250W超聲清洗器內(nèi)超聲1h，超聲后的溶液在4000r/min的條件下離心15min，上清液備用，沉淀重復上述步驟。合并上清液，調(diào)節(jié)pH值為TSG的等電點4.6靜置30min后，于8000r/min離心10min，所得沉淀即為粗TSG。再通過Osborn法將提取過TSG的沉淀與去離子水混合（33.3g/L），使用恒溫磁力攪拌器室溫攪拌1h，于8000r/min離心15min，所得上清液即為清蛋白，保留沉淀繼續(xù)提取鹽溶蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白，提取操作同上，但所用溶劑不同，依次為5%的NaCl溶液、70%乙醇和0.25%的NaOH溶液。本試驗主要對含量最高的，具有良好物化性質(zhì)的TSG進行研究，因此將提取的粗TSG溶于去離子水調(diào)節(jié)至中性pH7.0再通過葡聚糖凝膠柱層析法純化，獲得高純度TSG，冷凍干燥用于后續(xù)試驗。

1.3.2 SDS-PAGE測定分子質(zhì)量

根據(jù)Laemmli等的方法，采用SDS-PAGE凝膠電泳測定制備的TSG分子質(zhì)量。配制12%分離膠，5%濃縮膠，采用垂直電泳裝置電泳，考馬斯亮藍染色，通過凝膠呈像系統(tǒng)掃描，QuantityOne軟件分析。

1.3.3 巰基（SH）和二硫鍵（S-S）含量的測定

根據(jù)Wen等的方法稍加修改，對游離巰基含量進行測定，0.5mL1mg/mLTSG溶液加入2.5mLTris-Gly緩沖液（含8mol/L尿素，pH8.0）和0.02mL4mg/mLDTNB快速混合，將其置于25.0℃水浴30min后用分光光度計測定在412nm處的吸光度值，使用公式（1）計算游離SH含量。

式中：A₄₁₂—412nm處吸光值；D—蛋白樣品稀釋倍數(shù)；C—樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

參考Wen等的方法并適當修改，對二硫鍵含量進行測定，0.5mL1mg/mLTSG溶液加入5mLTris-Gly緩沖液（含10mol/L尿素，pH8.0）和0.1mLβ-巰基乙醇，于25.0℃混合反應1h，加入30mLTCA（質(zhì)量濃度120g/L）沉淀大分子蛋白并于10000r/min離心10min，重復3次，收集沉淀物溶于15mLTris-Gly緩沖液（含8mol/L尿素，pH8.0）中，加入0.15mLDTNB（4mg/mL）快速混合，將其置于25.0℃水浴30min，使用紫外分光光度計在412nm處測定吸光度值，進行S-S含量的計算，公式如（2）所示。

式中：C_′SH—總巰基含量，μmol/g；C_SH—游離巰基含量，μmol/g。

1.3.4 氨基酸的測定

參照衛(wèi)陽飛等的方法取0.50g蛋白樣品加入10mL6mol/L的鹽酸，于110.0℃水解24h，抽濾，經(jīng)60.0℃反復旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3次，定容至10mL，過0.45μm的濾膜，樣品備用。

采用PITC柱前衍生氨基酸分析法對氨基酸含量進行分析，精密量取800μL混合氨基酸標準品溶液，置于5mL離心管中。加入400μL1mol/L的三乙胺乙腈溶液，混勻，隨后精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液400μL，混勻后室溫放置1h，加入2mL正己烷，劇烈振搖，靜置10min，取下層溶液過0.22μm濾膜注入高效液相色譜儀中進行色譜分析并記錄色譜圖；另精密量取樣品測定溶液400μL，測定方法同上，參照GB5009124-2016對氨基酸含量進行計算。

相關鏈接：谷氨酸，丙烯酰胺，冰醋酸，三羥甲基氨基甲烷

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