1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

取不同濃度的LCP溶液液各0.04mL，按試劑盒加入反應(yīng)試劑一0.26mL、試劑二0.32mL、試劑三0.04mL、試劑四0.06mL，混勻，即為測(cè)定組。取等體積蒸餾水，同法制備對(duì)照組。依上述方法，不加試劑三，加蒸餾水補(bǔ)足體積，混勻，即為空白組。于37℃反應(yīng)10min，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，570nm讀取各組吸光度值A(chǔ)，平行測(cè)定3次，以V_C為陽(yáng)性對(duì)照組，如下公式（4）計(jì)算清除率。

式中：A₁：對(duì)照組吸光度值，A₂：測(cè)定組吸光度值，A₃：空白組吸光度值。

1.2.7.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別吸取1.47mg/mL的LCP溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，加80%甲醇補(bǔ)足至1mL，備用。取上述不同濃度的LCP溶液0.4mL，按試劑盒加入0.6mL工作液制，混勻，即得測(cè)定組。取0.4mL不同濃度的LCP溶液與0.6mL80%甲醇溶液為對(duì)照組。取0.4mL80%甲醇溶液與0.6mL工作液，充分混勻，即得空白組。室溫避光靜置30min使之充分反應(yīng)，無(wú)水乙醇調(diào)零，于517nm讀取吸光度值A(chǔ)，每個(gè)濃度的樣品重復(fù)測(cè)定3次，取均值，以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，按公式（5）計(jì)算清除率。

式中：A₁：測(cè)定組吸光度值，A₂：對(duì)照組吸光度值，A₃：空白組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Designexpert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化，用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1（a），LCP得率先隨pH的增大而增大。推測(cè)在一定范圍內(nèi)，增大pH，因形成羧基離子和去質(zhì)子胺，蛋白質(zhì)分子中含有更高的負(fù)電荷排斥力，使蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用增加，而增加LCP的溶解度；亦可能是因偏離LCP的等電點(diǎn)，而增加LCP的溶解度，最終使LCP得率增大。pH6時(shí)LCP的得率為（2.23%±0.05%），而后LCP得率隨pH增大而減小。推測(cè)較高pH水平下提取樣品時(shí)，因增加淀粉及其他雜質(zhì)物質(zhì)的溶出，而稀釋LCP的濃度。且在堿性條件下，酚類化合物易從藥材中釋放并與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合而后快速氧化，導(dǎo)致提取物的顏色呈褐色。經(jīng)方差分析，P=0.002＜0.01，表明pH對(duì)LCP得率的影響有極顯著性。綜合考慮，選取提取液pH5～7進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

從圖1（b）可發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)得率逐漸增加，這是由于隨著料液比的增大，溶液中分子擴(kuò)散和碰撞速率加快，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的溶解。當(dāng)料液比在1:15～1:25（g/mL）范圍內(nèi)，得率逐漸下降，推測(cè)是由于料液比增大而致蛋白質(zhì)分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質(zhì)，同時(shí)一些可溶性雜質(zhì)溶解阻礙蛋白質(zhì)溶出，且不利于獲得純度較好的蛋白質(zhì)。經(jīng)方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比對(duì)LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

從圖1（b）可發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)得率逐漸增加，這是由于隨著料液比的增大，溶液中分子擴(kuò)散和碰撞速率加快，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的溶解。當(dāng)料液比在1:15～1:25（g/mL）范圍內(nèi)，得率逐漸下降，推測(cè)是由于料液比增大而致蛋白質(zhì)分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質(zhì)，同時(shí)一些可溶性雜質(zhì)溶解阻礙蛋白質(zhì)溶出，且不利于獲得純度較好的蛋白質(zhì)。經(jīng)方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比對(duì)LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

在特定條件下，蛋白質(zhì)浸出需要一定時(shí)間達(dá)到平衡狀態(tài)；時(shí)間較短，分子擴(kuò)散效率一定，蛋白質(zhì)溶出量有限；延長(zhǎng)浸提時(shí)間蛋白質(zhì)得率呈下降趨勢(shì)，可能是由于蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間在堿性環(huán)境中會(huì)發(fā)生輕微水解和變性，而且時(shí)間延長(zhǎng)也會(huì)增加非蛋白物質(zhì)浸出，影響蛋白質(zhì)進(jìn)一步沉淀和蛋白制品的純度，且與同類豆類如豌豆、大豆和蠶豆相比，川芎富含不同的多糖，多糖與蛋白質(zhì)的相互作用可能導(dǎo)致川芎中提取蛋白的價(jià)值降低。經(jīng)方差分析，P=0.023＜0.05，表明提取時(shí)間對(duì)LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取提取時(shí)間1～2h進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析LCP提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

每組樣品平行測(cè)定3次，取平均值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖和統(tǒng)計(jì)分析。DesignExpert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。結(jié)果如表3所示，得擬合方程為

y=2.28+0.18A+0.21B+0.19C−0.055AB+0.078AC+0.13BC−0.47A²−0.34B²−0.54C²。

2.2.2 方差分析結(jié)果

如表4所示，模型F=40.23，Pr＞F＜0.01，說(shuō)明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項(xiàng)F=0.89，Pr＞F＞0.05，失擬項(xiàng)相對(duì)于純誤差影響不顯著，說(shuō)明回歸模型與實(shí)測(cè)值擬合度較好，適用性高，可以使用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果。各因素的影響大小為：提取時(shí)間＜提取溶劑pH＜料液比。通過(guò)F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，P_A、P_B、P_C均小于0.01，說(shuō)明提取時(shí)間、料液比、提取溶劑pH對(duì)LCP得率的影響極顯著。R²=0.9810，R²_Adj=0.9566，表示所建立的模型能夠很好地反映獨(dú)立變量和響應(yīng)變量之間的關(guān)系。

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