川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，性味辛溫，歸肝、膽、心包經(jīng)，具活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為著名的川產(chǎn)道地藥材。目前對(duì)川芎所含成分的研究，主要集中于小分子成分，對(duì)川芎大分子成分的研究甚少。前期研究初步表明，川芎中含有豐富的蛋白質(zhì)，且具有較好的抗氧化能力。天然蛋白質(zhì)因其來(lái)源豐富、可生物降解、環(huán)境友好性和高生物活性等特點(diǎn)，近年來(lái)成為天然抗氧化劑的研究熱點(diǎn)。

氧自由基對(duì)生物大分子、氨基酸、DNA、脂類和蛋白質(zhì)等造成氧化損傷且與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、神經(jīng)功能障礙和免疫系統(tǒng)減弱等慢性疾病的發(fā)生有關(guān)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物源蛋白質(zhì)具有抗凝血、抗腫瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性，如石斛蛋白提取液、葛根蛋白、豌豆蛋白、黑豆蛋白等均具有較好的抗氧化活性，對(duì)羥基自由基和DPPH自由基有良好的清除效果，大豆蛋白具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。目前，川芎蛋白（LCP）抗氧化能力的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法確定其最佳提取條件；以DPPH自由基清除、羥自由基清除和超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行分析，考察LCP的抗氧化活性，同時(shí)為L(zhǎng)CP的開(kāi)發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎，貴陽(yáng)濟(jì)仁堂藥業(yè)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)R250、十二烷基硫酸鈉、Maker、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（VC）北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒　蘇州格銳思生物科技有限公司。

PHS-3CpH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204電子天平，美國(guó)梅特勒托利多公司；FD冷凍干燥機(jī)，上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司；MultiskanFC酶標(biāo)儀，賽默飛（上海）世爾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白濃度測(cè)定

分別吸取5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液4、6、8、10、12、14、16、18、20μL于96孔板中，并用蒸餾水補(bǔ)足至20μL。分別加入200μLBCA工作液（BCA試劑與銅試液50:1）混勻，室溫靜置l0min，于650nm下檢測(cè)不同濃度牛血清蛋白溶液的吸光值A(chǔ)，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=2.2706x+0.0402（R2=0.9993）。川芎提取物中LCP濃度根據(jù)上述回歸方程求得。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

基于前期研究，以LCP得率為檢測(cè)指標(biāo)，分別以pH、提取時(shí)間、料液比為影響因素以設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 川芎藥材前處理

取干燥潔凈的川芎藥材，粉碎，過(guò)3號(hào)篩（50目）。稱取適量過(guò)篩后的川芎藥材粉末置于圓底燒瓶中，加4倍量沸程為30～60℃石油醚水浴回流脫脂1h，靜置后過(guò)濾，將川芎藥材粉末于通風(fēng)櫥自然晾干，備用。

1.2.2.2 LCP的提取

精密稱取川芎藥材粉末3g，平行三份，加入Tris-HCl（68mmol/L，0.5%SDS，5%甘油，10%β-巰基乙醇）溶液，置于4℃冰箱浸提1.5h。5000r/min離心10min，收集上清，加入3倍量10%TCA-丙酮，置−20℃冰箱沉淀1.5h，5000r/min離心10min，收集沉淀，分別用丙酮及80%丙酮洗滌3次，5000r/min離心10min，收集沉淀，冷凍干燥即得LCP，按公式（1）計(jì)算得率。

式中：M₁表示川芎蛋白凍干粉的質(zhì)量，g；M₂表示川芎藥材的質(zhì)量，g。

1.2.2.3 不同pH對(duì)LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定提取時(shí)間為1.5h，料液比為1:15g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）對(duì)LCP得率的影響。

1.2.2.3 不同pH對(duì)LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定提取時(shí)間為1.5h，料液比為1:15g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）對(duì)LCP得率的影響。

1.2.2.4 料液比對(duì)LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定提取時(shí)間為1.5h，提取液pH為6，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL）對(duì)LCP得率的影響。

1.2.2.5 提取時(shí)間對(duì)LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，固定料液比為1:20g/mL，提取液pH為6，研究提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對(duì)LCP得率的影響。

1.2.3 LCP提取條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件，以A（提取時(shí)間h）、B（料液比g/mL）、C（提取溶劑pH）為獨(dú)立變量，蛋白得率為響應(yīng)變量，采用DesignExport8.0.6的Box-Behnken響應(yīng)面方法（RSM）優(yōu)化過(guò)程。各組平行3次，因素和水平見(jiàn)表1。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳

采用賀小燕等試驗(yàn)方法，以4.5%的濃縮膠和12.5%的分離凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80V電泳20min，分離膠電泳120V電泳80min，指示劑到達(dá)分離膠底部約1cm處停止電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色至條帶清晰。

1.2.5 LCP等電點(diǎn)測(cè)定

取10支潔凈離心管，稱重。根據(jù)表2，分別加入不同體積LCP溶液（50mg/mL），再分別加入不同濃度、不同體積的乙酸溶液或去離子水，混合，測(cè)定pH。于4℃靜置1h后，5000r/min離心15min。完全除去上清液后，將帶有沉淀物的離心管稱重，通過(guò)減重法計(jì)算沉淀質(zhì)量。由于蛋白質(zhì)在pI處沉淀最多，即可測(cè)定川芎的pI。

1.2.6 LCP溶解度的測(cè)定

將50mg樣品懸浮在10mL蒸餾水中，并使用1mol/mL的HCl或NaOH溶液將懸浮液的pH調(diào)節(jié)至2～12。將懸浮液在22℃下連續(xù)攪拌1h，并在5000r/min離心15min，BCA試劑盒測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的量。溶解度按公式（2）計(jì)算。

式中：M₁：懸浮液中加入的蛋白總量，mg，M₂：離心后上清液蛋白的量，mg。

1.2.7 LCP抗氧化能力的測(cè)定

1.2.7.1 羥自由基清除能力的測(cè)定

取不同濃度的LCP溶液各0.125mL，按試劑盒加入反應(yīng)試劑一、試劑二、試劑三各0.125mL和0.5mL的蒸餾水，混勻，即為測(cè)定組。取等體積蒸餾水，依法制備空白組。取不同濃度的LCP溶液液各0.125mL，加入反應(yīng)試劑一、試劑二各0.125mL和0.625mL的蒸餾水，混勻，即為對(duì)照組。于37℃反應(yīng)20min，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，510nm讀取各組吸光度值A(chǔ)，平行測(cè)定3次，以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，公式（3）計(jì)算清除率。

式中：A₁：空白組吸光度值，A₂：測(cè)定組吸光度值，A₃：對(duì)照組吸光度值。

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