1.3.4 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用

細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定采用文獻(xiàn)中報(bào)道的DCFH-DA熒光探針法，并稍作修改。細(xì)胞孵育以及試驗(yàn)設(shè)置同1.3.3.3節(jié)，經(jīng)過最后一步H₂O₂孵育6h后，將96孔板中上清液吸棄，用PBS清洗細(xì)胞后，每孔加入20μLDCFH-DA溶液，放入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育20min后，用PBS清洗細(xì)胞3次后加入DMEM，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在激發(fā)波長(zhǎng)485nm、發(fā)射波長(zhǎng)525nm下的熒光強(qiáng)度。

1.3.5 體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）肽序列鑒定

1.3.5.1 肽序列鑒定

利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）進(jìn)行肽序列鑒定。色譜條件：流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；流速：300nL/min；洗脫程序：5%～35%B（60min），35%～75%B（4min），75%B（10min）。

1.3.5.2 肽的合成

通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的肽，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，純度達(dá)到98%以上。

1.3.6 合成肽的體外抗氧化活性

1.3.6.1 合成肽的ABTS⁺·清除能力測(cè)定

方法同1.3.2.1節(jié)。

1.3.6.2 合成肽的ORAC測(cè)定

方法同1.3.2.2節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)3次。用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性

2.1.1 ABTS⁺·清除能力測(cè)定

蛋白以及蛋白產(chǎn)物的ABTS自由基清除活性結(jié)果如圖1所示。可以看出，卵白蛋白及其消化產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除能力均具有濃度依賴性，大小順序依次為：體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物＜1ku、體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物1～3ku、體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物3～10ku、卵白蛋白，說(shuō)明卵白蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，其消化產(chǎn)物的ABTS自由基清除活性均有不同程度的增強(qiáng)，這一結(jié)論與文獻(xiàn)中已有的報(bào)道相符，說(shuō)明蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，產(chǎn)生了新的具有抗氧化活性的肽段或氨基酸?？梢园l(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量越小的組分表現(xiàn)出越強(qiáng)的ABTS自由基清除活性，其中，分子質(zhì)量＜0.05），最高濃度清除率達(dá)49.48%，F(xiàn)oh等以羅非魚為原料，得到蛋白水解物，同樣發(fā)現(xiàn)了分子質(zhì)量＜1ku的組分ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，與其它組分存在顯著性差異（P＜0.05），最高濃度清除率達(dá)49.48%，F(xiàn)oh等以羅非魚為原料，得到蛋白水解物，同樣發(fā)現(xiàn)了分子質(zhì)量＜1ku的組分清除ABTS自由基的能力最強(qiáng)，高于分子質(zhì)量＜3ku的組分和分子質(zhì)量＜5ku的組分。

2.1.2 ORAC測(cè)定

蛋白以及蛋白產(chǎn)物的氧自由基吸收能力結(jié)果如圖2所示。ORAC值最大的組分仍然為體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（5ku的組分仍然為體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku），依次為體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（1～3ku）、體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（5～10ku）、卵白蛋白。其中體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）和體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（1～3ku）的ORAC值分別為1.21μg/mLTE/μg/mL和2.07μg/mLTE/μg/mL，高于Trolox的ORAC值（1μg/mLTE/μg/mL）。這一結(jié)果與上述結(jié)果一致，說(shuō)明經(jīng)過體外模擬胃腸道消化，卵白蛋白被酶解，釋放出新的抗氧化肽段，抗氧化肽段表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧自由基吸收能力，并且分子質(zhì)量越小的肽段，ORAC值越大。這一結(jié)果與文獻(xiàn)中已有的報(bào)道相符：Vilcacundo等以藜麥蛋白為原料，經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，分子質(zhì)量＜5ku的組分ORAC值高于分子質(zhì)量＞5ku的組分。

2.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的細(xì)胞抗氧化活性

2.2.1 H₂O₂誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

不同濃度的H₂O₂對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響如圖3所示。H₂O₂容易通過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高活性自由基，從而引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷或凋亡。當(dāng)H₂O₂濃度由400μmol/L增加到900μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸降低，與未經(jīng)H₂O₂處理組（對(duì)照組）存在顯著性差異，當(dāng)H₂O₂濃度在700μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為48%，約為對(duì)照組細(xì)胞存活率的50%，當(dāng)H₂O₂濃度在900μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為13%，細(xì)胞氧化損傷過于嚴(yán)重，此時(shí)蛋白及其產(chǎn)物難以表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，綜合以上因素，選用700μmol/L的H₂O₂構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，探究體外模擬胃腸道消化的卵白蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞抗氧化活性。

2.2.2 卵白蛋白消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

卵白蛋白體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用結(jié)果如圖4所示。按照2.2.1節(jié)構(gòu)建得到的細(xì)胞氧化損傷模型，H₂O₂處理組（損傷組）細(xì)胞存活率約為對(duì)照組的50%，與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）。在H₂O₂處理細(xì)胞之前，用不同質(zhì)量濃度的肽（0.01，0.1，1mg/mL）處理細(xì)胞，體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（3～10ku）和體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（1～3ku）細(xì)胞存活率與損傷組細(xì)胞沒有顯著性差異（P＞0.05），對(duì)細(xì)胞沒有氧化損傷的預(yù)先保護(hù)作用。當(dāng)體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）質(zhì)量濃度為0.01mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率與損傷組細(xì)胞沒有顯著性差異（p＞0.05），隨著產(chǎn)物濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸提高，與損傷組存在顯著性差異（P＜0.05），表明體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物（＜1ku）對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。值得注意的是：由于模型中所采用的細(xì)胞為人結(jié)腸癌細(xì)胞系（Caco-2細(xì)胞），Caco-2細(xì)胞經(jīng)分化后類似小腸細(xì)胞并可表達(dá)成熟的小腸細(xì)胞的特征，進(jìn)而該細(xì)胞被廣泛用于吸收模型研究。推測(cè)卵白蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，被Caco-2細(xì)胞吸收，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用，從而提高細(xì)胞存活率。并且，在未經(jīng)H₂O₂處理、消化質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比表現(xiàn)為既不升高也不降低，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明消化產(chǎn)物對(duì)Caco-2細(xì)胞既沒有毒性作用，也不促進(jìn)細(xì)胞增殖。

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