2.4菌株L2-003-A-5的鑒定

2.4.1菌株L2-003-A-5的形態(tài)特征

菌株L2-003-A-5在掃描電鏡下的形態(tài)如圖2所示，菌株的氣生菌絲明顯呈卷曲螺旋狀；孢子呈短圓柱形，孢子的表面平滑；菌絲生長能力旺盛、分支明顯，可見散落的孢子分布。菌株L2-003-A-5在高氏一號瓊脂中生長迅速(圖3)，其氣生菌絲呈白色，基內(nèi)菌絲呈淡黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。將菌株L2-003-A-5在8種培養(yǎng)基中培養(yǎng)和觀察，結(jié)果顯示，氣生菌絲和基內(nèi)菌絲以白色偏淡黃為主，無可溶性色素產(chǎn)出，在酵母膏-麥芽膏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、營養(yǎng)瓊脂等3種培養(yǎng)基上的長勢較差(表2)。

2.4.2菌株L2-003-A-5的生理生化特征

菌株L2-003-A-5生長的pH范圍是6～9，最適pH為7；對NaCl耐受能力較差，只能在含1%NaCl的培養(yǎng)基中生長，且長勢較差；生長溫度為25～40℃，最適溫度為30℃；淀粉水解、纖維素水解、油脂水解、甲基紅、牛奶凝固和過氧化氫酶反應呈陽性，明膠液化反應、產(chǎn)H2S、檸檬酸鹽反應、硝酸鹽還原和苯丙氨酸脫氫酶反應呈陰性。

2.4.3菌株L2-003-A-516SrRNA基因部分序列分析

測序結(jié)果顯示，菌株L2-003-A-5的16SrRNA基因部分序列長度為1493bp，在GenBank核酸登錄號為KT119348。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株L2-003-A-5屬于鏈霉菌屬細菌，與典型菌株Streptomy-cessomaliensisNBRC12916T、Streptomycesalbidofla-vusDSM40455T、氫化鏈霉菌(Streptomyceshydroge-nans)NBRC13475T、淺紫鏈霉菌(Streptomycesviola-scens)ISP5183T、StreptomycesdaghestanicusNRRLB-5418T和StreptomyceskoyangensisVK-A60T聚為一簇，與這些菌株的16SrRNA基因相似性均為99.9%；與典型菌株StreptomycesdaghestanicusNRRLB-5418T和StreptomyceskoyangensisVK-A60T的16SrRNA基因相似性分別為99.7%和99.4%。通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株L2-003-A-5及相關(guān)菌株16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。綜合分析與菌株L2-003-A-5相似性最近的菌株的形態(tài)特征、生理生化特征和16SrRNA基因序列比對(Rongetal,2009；魏玉珍等,2010；秦盛等,2009；譚力等,2015；王毓舒,2011；Kye,Yong,1993)，判斷L2-003-A-5為一株微白黃鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。

2.5菌株SC-168-A-2的鑒定

2.5.1菌株SC-168-A-2的形態(tài)特征

菌株SC-168-A-2在掃描電鏡下的形態(tài)如圖2所示，菌株的氣生菌絲呈長直孢子鏈狀；孢子呈短圓柱形，四周呈內(nèi)陷形態(tài)；菌絲生長能力旺盛、分支明顯。在供試的8種培養(yǎng)基中，SC-168-A-2的氣生菌絲以白色為主，基內(nèi)菌絲以淡黃或白色為主；在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長狀況較差(表2)，在包括高氏一號培養(yǎng)基(圖3)在內(nèi)的培養(yǎng)基中均不產(chǎn)生可溶性色素。

2.5.2菌株SC-168-A-2的生理生化檢測

適于菌株SC-168-A-2生長的pH范圍是6～9，最適pH為7和8；菌株SC-168-A-2能耐受8%Na‐Cl；生長溫度范圍為15～45℃，最適溫度為30℃；淀粉水解、纖維素水解、油脂水解、牛奶凝固、產(chǎn)H2S反應、過氧化氫酶反應和甲基紅反應呈陽性，明膠液化、硝酸鹽還原和苯丙氨酸脫氫酶反應呈陰性。

2.5.3菌株SC-168-A-216SrRNA基因部分序列分析

菌株SC-168-A-2的16SrRNA基因部分序列長度為1436bp，在GenBank核酸登錄號為KR140205。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株SC-168-A-2屬于鏈霉菌屬，與典型菌株Streptomycespraten-sisch24T系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，16SrRNA基因相似性為99.8%；與另外3個典型菌株Streptomycesgriseopla-nusAS4.1868T、StreptomycescyaneofuscatusJCM4364T和StreptomycesanulatusNRRLB-2000T的16SrRNA基因相似性分別為99.1%、98.5%和98.3%。綜合分析形態(tài)特征、生理生化特征和16SrRNA基因部分序列(楊桂柳等,2015；Kimetal,2012)，判定菌株SC-168-A-2屬于鏈霉菌屬的Streptomycespratensis。通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株SC-168-A-2及相關(guān)菌株16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。

3討論

本研究篩選了3株對煙草青枯病原菌拮抗效果良好的放線菌，經(jīng)鑒定均為鏈霉菌，而目前已見報道的拮抗煙草青枯病原菌的放線菌種類絕大多數(shù)也是鏈霉菌，本研究結(jié)果驗證了鏈霉菌在這方面的良好效果。已報道的能拮抗煙草青枯病原菌的鏈霉菌種類主要包括薰衣草鏈霉菌(S.lavendulae)(張薇,2009)、橄欖綠鏈霉菌(S.olivaceoviridis)、粉紅孢類群玫瑰暗黃鏈霉菌(S.roseofulvus)(陸錚錚,蔣選利,2015)、婁徹氏鏈霉菌(S.rochei)(王巖,2009)等，本研究結(jié)果豐富了鏈霉菌拮抗煙草青枯病原菌的種類。另外，已有的研究表明，可用于農(nóng)業(yè)生物防治的放線菌中60%是鏈霉菌(Tanaka,Omura,1993)，這可能是因為鏈霉菌是革蘭氏陽性細菌放線菌科中最大的屬，種類繁多，在各種生活環(huán)境中分布廣泛，更重要的是鏈霉菌可以產(chǎn)生大量種類豐富的活性次生代謝產(chǎn)物(Kimetal.,2003；Parketal.,2008；Wangetal.,2007)，這些代謝產(chǎn)物具有多樣的功能，可廣泛應用于農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域。本研究篩選所得的鏈霉菌種類也有在農(nóng)業(yè)生物領(lǐng)域的報道，如S.microflavus具有促進植株生長(張琪等,2018；郭建軍等,2013)、產(chǎn)生抗菌活性(王磊,2011；黃燦等,2007)等特性，S.albidoflavus也有抗菌能力(張雯龍等,2012；周麗娜等,2015；戚珊珊,2011；于素亞等,2012)，但這些微生物在拮抗煙草青枯病原菌的特性方面鮮有報道。另外，目前報道的多數(shù)煙草病原菌的拮抗微生物不止對一種病原菌具有抑制作用(易有金,2007；展麗然等,2008；王娜娜,2012)，而此特性是拓寬拮抗微生物應用范圍的重要基礎(chǔ)。本研究所篩選獲得的拮抗放線菌對赤星病菌及辣椒、番茄、馬鈴薯等茄科類植物青枯病菌均有抑制作用，抑菌范圍廣，提示各拮抗菌株具有用于研制生物有機肥的潛力，具有進一步開發(fā)研究的價值。

4結(jié)論

本研究從四川2個煙草種植區(qū)的根際土中分離篩選獲得3株拮抗煙草青枯病原菌的放線菌；對抑菌譜的測定發(fā)現(xiàn)，該3株菌不僅對煙草青枯病原菌具有較好的拮抗效果，對煙草赤星病及辣椒、番茄、馬鈴薯青枯病的病原菌均有抑制效果。結(jié)合表型特征、生理生化特征和遺傳特征分析，確定3株放線菌均為鏈霉菌，分別屬于Streptomycesmicroflavus、Streptomycesalbidoflavus和Streptomycespratensi。

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