自1908年發(fā)現(xiàn)煙草青枯病這種典型的維管束病害以來，國內(nèi)外許多學(xué)者致力于煙草青枯病的防治研究，并獲得多種防治方法，其中主要包括化學(xué)防治(陳澤棚等,2011)、選育抗病煙草(Nicotianatabacum)品種防治(方樹民等,2001)、通過耕作制度管理防治(萬川等,2015)和生物防治等。我國針對煙草青枯病的生物防治研究起步較晚，需要加大研究力度以解決煙草種植業(yè)中面臨的問題。煙草青枯病的生物防治方法主要有無致病力(avirulent-strains)青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)的應(yīng)用(謝銳鴻等,2014；肖田等,2008；肖田等,2015)和拮抗煙草青枯病原菌的應(yīng)用，以及利用其他植物的提取物進(jìn)行防治等(鄧正平等,2003；陳啟建等,2004；劉學(xué)端,肖啟明,1997；賴榮泉等,2011)。目前已有報(bào)道的拮抗煙草青枯病原菌的微生物主要種類為細(xì)菌中的芽胞桿菌屬(Bacillus)(何玉安等,2018；張欣悅等,2020；劉艷霞等,2020)和假單胞菌屬(Pseudo-monas)(胡軍華等,2009；董夏偉等,2011)，其他種類的微生物相對較少。已有的研究表明，拮抗煙草青枯病原菌的放線菌類微生物主要是鏈霉菌(Strepto-myces)(羅文建等,2017；張薇,2009)。施用添加拮抗菌的有機(jī)肥對控制煙草青枯病和提高產(chǎn)量具有良好的效果(張欣悅等,2020；張明宇等,2020)。本研究針對四川省煙草主栽區(qū)，從涼山州和瀘州市的煙草根際土壤中共分離獲得3株拮抗煙草青枯病原菌的放線菌，并對其進(jìn)行鑒定，以期加速煙草青枯病原菌拮抗菌應(yīng)用于生物有機(jī)肥的進(jìn)程，為生物有機(jī)肥研制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試病原菌

煙草(Nicotianatabacum)青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)，由云南省煙草科學(xué)研究院惠贈。煙草猝倒病原菌-瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、煙草黑脛病原菌-寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和煙草赤星病原菌-鏈格孢(Alternariaalternata)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)區(qū)劃與農(nóng)業(yè)資源研究所惠贈。辣椒(Capsicumannuum)青枯病原菌ZT3721由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院惠贈。番茄(Solanumlycopersicum)青枯病原菌GIM1.70和馬鈴薯(Solanumtuberosum)青枯病原菌GIM1.74購買自廣東微生物菌種保藏中心。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，pH7.4。TM培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，酪素水解物(trypticase)1.0g，瓊脂粉18.0g。

1.3拮抗菌的篩選

結(jié)合噴霧法和雙層平板法初步篩選拮抗菌株(王羽,肖崇剛,2004；趙斌,何紹江,2002；Sooheeetal,2008)，復(fù)篩時將初篩所得菌株接入LB培養(yǎng)液中進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液與煙草青枯病原菌進(jìn)行平板對峙實(shí)驗(yàn)(吳翔等,2019)，在TM培養(yǎng)基中涂布病原菌的菌液，再用直徑6mm的打孔器在培養(yǎng)皿中央打1個孔，在孔中接入20μL初篩拮抗菌的發(fā)酵液，記錄孔周圍的抑菌圈直徑。抑菌圈直徑反映各菌株對病原菌的抑制能力。

1.4拮抗菌抑菌譜測定

分別測定拮抗菌固體菌體和發(fā)酵液對待測病原菌的拮抗能力，測定方法為平板對峙法。用直徑為6mm的打孔器先在盛有TM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央打1個孔，然后在距離平板中心相等的3個方向分別打孔。從完成培養(yǎng)的病原菌平皿中打孔獲得同樣大小菌餅，置于空白培養(yǎng)基的中央孔，四周孔分別接入拮抗菌菌餅和發(fā)酵液，于28℃正置培養(yǎng)，觀測抑菌情況。

1.5菌株鑒定

1.5.1形態(tài)特征分析

顯微形態(tài)特征分析：放線菌的菌絲和孢子形態(tài)用高氏一號培養(yǎng)基(趙斌,何紹江,2002)埋片培養(yǎng)。將瓊脂平板挖長方形小穴，于穴邊緣接種篩選出的菌株，蓋上無菌蓋玻片，適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，菌體長在蓋片上。第5天取出蓋片，風(fēng)干樣品，鍍膜后在JSM7500F型掃描電鏡(JEOL,日本)下觀察超微結(jié)構(gòu)。

培養(yǎng)形態(tài)特征分析：參照有關(guān)放線菌培養(yǎng)特征所采用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(Shirlingetal,1966)。選用以下8種培養(yǎng)基：察氏瓊脂、葡萄糖-天門冬酰胺瓊脂、麥芽膏-酵母膏瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂、燕麥片瓊脂、無機(jī)鹽淀粉瓊脂、甘油-天門冬酰胺瓊脂、營養(yǎng)瓊脂，分別在平板劃線接種3株放線菌，30℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3和5天，觀測氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色及其生長情況，觀察并記錄是否產(chǎn)生可溶性色素及其顏色。將放線菌劃線接種于高氏一號培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱適溫、適時培養(yǎng)，對菌落形態(tài)拍照。

1.5.2生理生化特征分析

生長的pH范圍：將高氏一號培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10、11，將待測菌株接入培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)，觀測菌株的生長情況，確定最適pH值及范圍。生長溫度實(shí)驗(yàn)：將放線菌接入高氏一號培養(yǎng)基，分別于7、15、25、30、40、45、50和55℃培養(yǎng)，于第3天和第7天觀察菌株的生長狀況，確定各菌株的最適生長溫度及范圍。NaCl耐受實(shí)驗(yàn)：分別在高氏一號培養(yǎng)基中添加1%、4%、8%和10%(W/V)NaCl，將菌株接入培養(yǎng)基，檢測各菌株對NaCl的耐受性。其他生理生化檢測參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(趙斌,何紹江,2002)進(jìn)行操作。

1.5.3總DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用杭州博日科技有限公司的試劑盒進(jìn)行待測菌株基因組DNA提取。用細(xì)菌通用引物對(正向引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3')擴(kuò)增菌株16SrRNA基因；以獲得的DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(吳翔等,2019)。由上海生工生物工程有限公司合成引物并對PCR產(chǎn)物測序。將測得的16SrRNA基因序列提交GenBank,獲得各菌株的核酸登錄號。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株篩選

采用噴霧法和雙層平板法初篩拮抗菌株，以能產(chǎn)生明顯的拮抗圈為特征進(jìn)行篩選，初步篩選出對煙草青枯病原菌具有拮抗作用的放線菌6株(圖1A)。利用平板對峙法再從初篩的菌株中復(fù)篩，結(jié)果顯示，其中3株放線菌(SC-105-B-10,L2-003-A-5,SC-168-A-2)的發(fā)酵液在培養(yǎng)基上的抑菌圈明顯，抑菌圈直徑分別為30.67、17.03和30.33mm(圖1B)。

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