2.3 巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的吞噬不依賴于血清調(diào)理

為了探究巨噬細(xì)胞對(duì)酵母孢子識(shí)別是否依賴于血清中補(bǔ)體或抗體成分，檢測(cè)無血清培養(yǎng)基對(duì)吞噬野生型孢子效率的影響。如圖3(a)所示，每100個(gè)巨噬細(xì)胞于有、無血清情況下吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的個(gè)數(shù)分別為42、38和338、322，統(tǒng)計(jì)分析無顯著性差異，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子的吞噬不依賴于血清中補(bǔ)體和免疫球蛋白成分。圖3(b)顯示，無血清條件下攝入營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母或野生型孢子的巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞的比率分別為18％和83％，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)野生型孢子有更高效的內(nèi)吞作用。因此，巨噬細(xì)胞對(duì)野生型孢子的吞噬不是依賴于血清中補(bǔ)體和抗體調(diào)理導(dǎo)致的間接吞噬.這種吞噬極有可能是孢子表面存在的物質(zhì)被巨噬細(xì)胞識(shí)別從而引起吞噬。

2.4 巨噬細(xì)胞吞噬酵母孢子的配體為共價(jià)結(jié)合到孢子壁的非蛋白質(zhì)成分

為了進(jìn)一步探究孢子壁上何種物質(zhì)作為分子配體導(dǎo)致野生型酵母孢子的高效吞噬，通過高鹽洗滌除去吸附在野生型酵母孢子壁上的分子，利用蛋白酶處理孢子壁并比較其吞噬效率。如圖4所示，處理后的酵母孢子吞噬效率與對(duì)照組吞噬效率無顯著差異，這表明野生型孢子表面被巨噬細(xì)胞識(shí)別的主要配體不是吸附于二酪氨酸層的物質(zhì)。而是共價(jià)結(jié)合到二酪氨酸層的物質(zhì)，并且這種分子配體物質(zhì)不是蛋白質(zhì)。

2.5 巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母依賴于葡聚糖配體，而酵母孢子不依賴

微生物表面的糖鏈能夠被巨噬細(xì)胞所識(shí)別，從而引起吞噬俐。為了探究巨噬細(xì)胞吞噬營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子與糖鏈配體是否有關(guān)，通過一系列糖鏈作為配體競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。昆布糖(直鏈的葡聚糖)能夠抑制由于酵母葡聚糖配體引起的吞噬，因此選取昆布糖作為對(duì)照組。從圖5可知。昆布糖能夠顯著地抑制巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球的吞噬，但對(duì)野生型酵母孢子的吞噬無顯著影響。圖5表明，甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及巖藻糖對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母以及野生型酵母孢子的吞噬均無顯著影響。因此巨噬細(xì)胞通過識(shí)別營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球上葡聚糖配體介導(dǎo)吞噬，但野生型酵母孢子表面被巨噬細(xì)胞識(shí)別的配體不是葡聚糖或甘露聚糖等糖鏈，巨噬細(xì)胞識(shí)別營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的配體不同。

2.6 巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的識(shí)別依賴于二酪氨酸層結(jié)構(gòu)

為了探究野生型孢子表面被識(shí)別的配體，比較巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子(AN12D孢子)、dit1△孢子和shs3△孢子的效率。Dit1△菌株是野生型酵母敲除二酪氨酸層合成基因DITI后得到的菌株，因此dit1△孢子無二酪氨酸層。Chs3△菌株是野生型酵母敲除酵母孢子殼聚糖層合成基因CHS3后得到的菌株，因此chs3△孢子無殼聚糖層。由于二酪氨酸層的合成是依賴于殼聚糖層的存在，因此chs3△孢子也無二酪氨酸層的存在。統(tǒng)計(jì)每100個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子、dit1△孢子和chs3△孢子的個(gè)數(shù)，從圖6可知，巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的吞噬效率顯著高于dit1△孢子和chs3△孢子。如圖6(b)所示。酵母dit1△孢子和chs3△孢子與野生型酵母孢子大小相似，但巨噬細(xì)胞對(duì)野生型孢子的吞噬更為高效，這表明巨噬細(xì)胞對(duì)野生型酵母孢子的高效吞噬不是因?yàn)槠渲睆叫∮跔I(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母，而是因?yàn)橐吧徒湍告咦颖谧钔鈱佣野彼釋拥拇嬖谑蛊淠鼙痪奘杉?xì)胞識(shí)別，從而介導(dǎo)吞噬的發(fā)生。
 

3 結(jié)語

釀酒酵母孢子形態(tài)對(duì)免疫細(xì)胞的作用未被詳細(xì)研究，作者通過比較巨噬細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的內(nèi)吞效率，發(fā)現(xiàn)野生型酵母孢子能夠更高效地被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞。進(jìn)一步研究表明：野生型酵母孢子和營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的內(nèi)吞是依賴于Svk的受體介導(dǎo)的吞噬作用，但野生型酵母孢子的吞噬相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母而言極其依賴P13K，這表明巨噬細(xì)胞吞噬野生型孢子和營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬信號(hào)途徑也有所不同。營(yíng)養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬配體是葡聚糖，但野生型酵母孢子的吞噬不依賴于葡聚糖配體，其高效吞噬與野生型孢子壁二酪氨酸層有關(guān)。

本研究表明，巨噬細(xì)胞高效吞噬野生型酵母孢子是依賴于二酪氨酸層，對(duì)這種配體的分子研究讓我們能夠找到一種可利用的、作為載體的生物分子配體，可將外源物質(zhì)高效傳遞到巨噬細(xì)胞體內(nèi)，為日后開發(fā)一種無毒、高效的靶向巨噬細(xì)胞的生物介質(zhì)提供理論依據(jù)。

相關(guān)鏈接：酪氨酸，葡聚糖，殼聚糖，甘露糖

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