2.3 誘導時間對重組β-葡聚糖水解酶的影響

2.3.1 誘導時間對Gly5m的影響

由2.2.1可知，重組蕃E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-gly5m在25℃誘導時酶活最高，故將重組菌在25℃分別誘導4、6、8、10h。離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內粗酶液，結果見圖4（a）。重組菌在25℃誘導4h后，重組β-葡聚糖水解酶Gly5m總酶活達到最高，為1086U/mL，且此時胞外酶活也達到最高，為888U/mL。此外，重組菌在誘導時間超過4h后，總酶活開始下降，說明Glv5m不穩(wěn)定，開始降解。

2.3.2 誘導時間對BT3312的影響

由2.2.2可知，重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-bt3312在25℃誘導時酶活最高，故將重組菌在25℃分別誘導4、6、8、10h。離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內粗酶液，結果見圖4(b)。重組菌在30℃誘導8h后，總酶活達到最高，為2355U/mL,且此時胞內、胞外酶活均達到最高,分別為917、1438U/mL。此外，重組菌在誘導時間超過8h后，酶活開始下降，說明BT3312也不穩(wěn)定。

2.4 重組β-葡聚糖水解酶的水解產(chǎn)物HPLC分析

以未經(jīng)重組β-葡聚糖水解酶水解的酵母葡聚糖為對照，對3個實驗組水解產(chǎn)物進行HPLC分析，結果見圖5。兩種重組酶都有水解酵母葡聚糖的能力，且兩種重組酶可以同時添加共同發(fā)揮作用。比較3種水解方式所得產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BT3312水解后，所得產(chǎn)物相對分子質量最大，推測原因可能是BT3312專一性水解β-1，6-糖苷鍵，而在酵母β-葡聚糖中，β-1，6-葡聚糖少，占10％～15％，因此通過BT3312水解后，所得產(chǎn)物中大部分的β-葡聚糖沒有水解，故相對分子質量大。反之，Glv5m主要水解β-l，3-糖苷鍵，在酵母β-葡聚糖中，β-1，3-葡聚糖多，故經(jīng)Glv5m水解后，所得產(chǎn)物相對分子質量更小。此外，當BT3312和Glv5m共同水解時，水解最徹底，剩余的底物最少，推測原因是酵母β-葡聚糖中同時含有β-l，3-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵，而β-l，6-糖苷鍵的存在可能會影響β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m發(fā)揮作用，故當β-l，6-葡聚糖水解酶BT3312水解掉β-1，6-糖苷鍵后，Gly5m才能更好地發(fā)揮水解作用，使水解更加徹底。

2.5 重組β-葡聚糖水解酶水解產(chǎn)物的溶解率

酵母β-葡聚糖經(jīng)過Gly5m和BT3312單獨或共同水解后，溶解率均有增加，結果見圖6。添加相同酶量水解時，同時添加Glv5m和BT3312，水解產(chǎn)物溶解率增加量最多，從12％增加到50％，水溶性酵母葡聚糖質量濃度為12.5g/L。當Gly5m和BT3312共同水解時，酵母葡聚糖水解最徹底，前后結果一致。當只用Glv5m水解時，酵母葡聚糖溶解率提高了2.6倍，水溶性酵母葡聚糖質量濃度為11g/L；當只用BT3312水解時，酵母葡聚糖溶解率提高了2.4倍。水溶性酵母葡聚糖質量濃度為10.25g/L。

3 結語

酵母β-葡聚糖廣泛應用于醫(yī)療、保健食品和化妝品行業(yè)中，但因為其水不溶性，限制了它的應用。作者在E.coli中表達了兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶，兩種酶不僅都有水解酵母β-葡聚糖的能力，而且可以同時發(fā)揮作用。通過兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶的水解作用，使得酵母β-葡聚糖溶解性增加，且結構和活性不被破壞。但是，兩種水解酶在E.coli中表達量低,SDS-PAGE檢測分析中沒有明顯條帶，為進一步提高表達量和酶活，可通過優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、構建不同啟動子的表達系統(tǒng)等進行嘗試表達。此外，作者對兩種酵母β-葡聚糖水解酶共同水解酵母葡聚糖以提高其水溶性只進行了初步探索，為進一步提高水解效率，可以優(yōu)化水解條件、添加的酶活濃度以及兩種水解酶的比例。

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