1.2.5 重組β-葡聚糖水解酶水解產(chǎn)物HPLC分析

水解條件：20mmol/LPBS緩沖液(pH7.5)，酵母葡聚糖4g/L，酶活10U/mL。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：第一組只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二組只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312；第三組同時(shí)添加等酶活的β-l，3-葡聚糖水解酶Glv5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。37℃下反應(yīng)12h，取樣分析。水解樣品使用孔徑0.22μL的濾膜過濾后，采用高效體積排阻色譜和多角度激光散射聯(lián)用進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。采用Ultmhydrogel刪色譜柱(300mm×7.8mm，美國沃特斯公司)、多角度激光散射檢測(cè)器(美國懷雅特公司)檢測(cè)和示差折光檢測(cè)器(美國懷雅特公司)檢測(cè)。條件：0.1mol/LNaN03溶液作為流動(dòng)相，流速恒定保持在0.6mL/min，柱溫保持在40℃，進(jìn)樣量為10μL。

1.2.6 重組β-葡聚糖水解酶產(chǎn)物溶解率測(cè)定

水解條件：20mmol/LPBS緩沖液(pH7.5)，酵母葡聚糖25g/L，酶活200U/mL。設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：第一組只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二組只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312；第三組同時(shí)添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。37℃反應(yīng)12h，定時(shí)取樣。樣品于12000r/min離心10min，用蒽酮法測(cè)定上清液中的總糖質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增和重組載體的構(gòu)建

2.1.1 pET-28a(+)-gly5m的構(gòu)建

以合成的gly5m為模板，引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約2700bp的片段，見圖2(a)。

采用DNA純化回收試劑盒對(duì)單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的gly5m片段與用BamHI和XhoI酶切后得到的線性質(zhì)粒pET-28a(+)-gly5m連接，轉(zhuǎn)化E.ColiJMl09，挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，重組載體pET-28a(+)-gly5m構(gòu)建成功。

2.1.2 pET-28a(+)-bt3312的構(gòu)建

以合成的bt3312為模板,引物F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約1600bp的片段，見圖2(b)。采用DNA純化回收試劑盒對(duì)單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的bt33122片段與用BamHI和XhoI酶切后得到的線性質(zhì)粒pET-28a(+)-6bt3312連接，轉(zhuǎn)化E.ColiJMl09，挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，重組載體pET-28a(+)-bt3312構(gòu)建成功。

2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組β-葡聚糖水解酶的影響

2.2.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)Gly5m的影響

將重組菌EcoliBL21(DE3)-pET-28a(+)-gly5m分另0在20、25、30℃下誘導(dǎo)12h，離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖3(a)。重組菌分別在20、25、30℃下誘導(dǎo)12h后，所得重組β-葡聚糖水解酶Glv5m總酶活分別為605、707、559U/mL。結(jié)果表明，溫度對(duì)重組β-葡聚糖水解酶Gly5m的酶活影響較小。另外,重組菌在30℃誘導(dǎo)12h后，Glv5m都分泌到胞外，細(xì)胞破碎上清液無酶活；在20、25℃誘導(dǎo)12h后，細(xì)胞破碎上清液中還存在少量重組β-葡聚糖水解酶。

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)BT3312的影響

將重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-gly5m分別在20、25、30℃下誘導(dǎo)12h后，離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖3(b)。重組菌在30、25、20℃下誘導(dǎo)12h后，所得重組β-葡聚糖水解酶BT3312總酶活分別為l652、1896、1888U/mL，25℃誘導(dǎo)時(shí)酶活最高。另外，重組菌在20℃誘導(dǎo)時(shí)，BT3312胞內(nèi)酶活最高。結(jié)果表明，溫度不僅影響B(tài)T3312的酶活，同時(shí)也會(huì)影響B(tài)T3312向胞外分泌。

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