芫荽為葉菜類，其表面微生物數(shù)量多，種類復雜。微生物的侵染不僅會影響芫荽的外觀，實質(zhì)上也降低了食用價值，減少貨架期時間”。芫荽種植的土壤、氣候等環(huán)境條件不同，隨著種植技術(shù)的提高與范圍的擴大，鮮切加工規(guī)模的不斷擴大，從田間到餐桌的環(huán)節(jié)增多，這些都增加了鮮切芫荽微生物污染的風險，也增加了微生物控制的難度。

次氯酸鈉、氯氣、次氯酸鈣等能在水中產(chǎn)生次氯酸的殺菌劑總稱為含氯殺菌劑，其中次氯酸鈉是目前應用最廣泛的含氯殺菌劑。此殺菌劑以氯為主，在水溶液中形成有強氧化性的次氯酸，次氯酸可穿透微生物的細胞膜進人細胞，與胞內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)生氯化反應從而凝固細胞液，可有效殺死細菌，效果明顯且反應速度快。目前，很多企業(yè)主要使用次氯酸鈉作為殺菌劑，并主要監(jiān)測菌落總數(shù)與大腸菌群的控制情況。由于次氯酸鈉可能存在氯殘留而對人體健康產(chǎn)生危害嘲，因此需要擴充綠色安全的殺菌劑種類，不斷挖掘新的殺菌劑并嚴格控制其使用濃度。

過氧乙酸是一種酸性強氧化劑，易溶于水、乙醇、乙醚、硫酸等溶劑，有強烈的刺激性酸味，對人的眼睛、皮膚、黏膜和上呼吸道有刺激作用，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇熱或有機物、金屬離子、強堿等易分解。

過氧乙酸可殺滅細菌繁殖體、真菌、病毒、分枝桿菌、細菌芽孢等微生物，且在低溫下仍有效，其殺菌效果受濃度、溫度、相對濕度、有機物等因素影響網(wǎng)。過氧乙酸在質(zhì)量濃度為50mg/1下就能達到良好的殺菌效果，幾乎對所有鮮切果蔬表面的腐敗菌和致病菌有明顯抑制效果，但因其穿透力不強，低濃度下雖對懸浮的微生物效果明顯，而對緊緊吸附在鮮切產(chǎn)品表面的微生物作用不明顯嘲。過氧乙酸反應的副產(chǎn)物是水和氧氣，對人體和環(huán)境無毒無害，因此被認為是一種綠色環(huán)保的殺菌劑，F(xiàn)DA已將其定為非沖洗食品接觸表面消毒殺菌劑。過氧乙酸作為氯系殺菌劑的替代品，在鮮切果蔬加工中得到廣泛研究與應用。

與含氯制劑相比，二氧化氯不會與有機物反應生成致癌、致突變、致畸的物質(zhì)，是目前國際上公認。的最新一代高效、廣譜、安全的殺菌保鮮劑同。它能迅速氧化病毒蛋白質(zhì)衣殼中的酪氨酸，抑制病毒的特異性吸附，阻止其對宿主細胞的侵染，還能與細菌及其他微生物蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應，分解破壞氨基酸，抑制微生物蛋白質(zhì)合成，從而導致微生物死亡。許多歐美國家有關(guān)組織已批準和推薦二氧化氯用于食品的消毒、防腐、保鮮等，世界衛(wèi)生組織(WH0)已將二氧化氯列為A1級安全高效消毒劑，我國衛(wèi)計委也已批準二氧化氯為消毒劑和新型食品添加劑。

上述3種減菌劑在鮮切芫荽中的減菌效果還缺乏研究，因此作者采用次氯酸鈉、二氧化氯和過氧乙酸處理鮮切芫荽，確定適合于鮮切蕪荽的最佳減菌劑，通過16SrDNA全基因組測序技術(shù)鑒定鮮切芫荽表面細菌種類，分析主要致病與致腐細菌，以期更有效地提高鮮切芫荽產(chǎn)品的安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芫荽：市售。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

次氯酸鈉、二氧化氯、過氧乙酸、氯化鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、乳糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、月桂酸硫酸鈉、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、結(jié)晶紫、草酸銨、碘片、碘化鉀、番紅、松柏油、SK1201-UN10-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒等。

1.2.2 主要儀器

DJ300精密電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；YXQ-SG41-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司產(chǎn)品：SW-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品：HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司產(chǎn)品：SPX-320型智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠產(chǎn)品；PCR反應擴增儀：加拿大BBI公司產(chǎn)品：3730測序分析儀：美罔ABI公司產(chǎn)品；H6-1微型電泳槽：上海精益有機玻璃制品儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：GeneGenius公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品及減菌劑的準備

挑選無黃葉、無機械傷、無病蟲害、新鮮度基本一致的本地鮮切芫荽，去根，清水洗至可直接食用，晾干至無水漬，待用。

次氯酸鈉(5.2mg/1)配制成質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200、250mg/1的溶液，測定pH分別為6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。

二氧化氯(8mg/1)配制成質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100mg/1的溶液，測定pH分別為5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。

過氧乙酸(15.7mg/1)，由A液(冰醋酸和硫酸)和B液(過氧化氫)以體積比10:8制得1000mg/1溶液，反應24h后稀釋成0、50、100、150、200、250mg/1，測定PH分別為6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。
1.3.23種減菌劑處理

比較3種減菌劑減菌效果，選擇效果最佳的減菌劑，以優(yōu)化減菌劑處理參數(shù)。3種減菌劑處理條件見表1。所有處理在室溫下進行，每個處理重復3次。

1.3.3 二氧化氯正交處理

按照1₉(3⁴)正交表，對處理濃度(20、40、60mg/1)、處理時間(2、5、10min)、水菜體積質(zhì)量比(4m1:1g、8m1:1g、12m1:1g)三因素進行正交試驗，對照組為清水洗前及清水洗后待用的樣品。正交試驗表見表2。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 菌落總數(shù)

參照GB/T4789.2-2016。

1.4.2 大腸菌群

參照GB/T4789.3-2016。

1.5 細菌的分離純化與保藏

無菌環(huán)境下，稱取25g鮮切芫荽置盛有225m1無菌生理鹽水的錐形瓶中，置于搖床80r/min，搖動20min，立即將樣品液稀釋至1×10^-3、1×10^-1、1×10^-5二三個梯度，吸取1m1樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個重復同時，分別吸取1m1無菌生理鹽水加入2個無菌平皿內(nèi)作空白對照。及時將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。于(36±1)℃倒置恒溫培養(yǎng)(48±2)h。試驗重復3次、觀察細菌的生長情況及菌落的顏色和特征，并選取優(yōu)勢菌挑取單菌落，采用平板劃線法于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基劃線純化。于(36±1)℃倒置恒溫培養(yǎng)(48±2)h。連續(xù)純化5代。

挑取純化第5代的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨斜面，于(36±1)℃倒置恒溫培養(yǎng)(24±2)h。置于4℃冰箱中保藏。

1.6 細菌形態(tài)觀察

1.6.1 簡落形態(tài)觀祭

觀察純化第5代平皿內(nèi)菌落大小、菌落形態(tài)、菌落顏色、菌落表面特征(光滑與否、干燥與否、是否凸起、是否透明、是否存在同心環(huán)等)、邊緣規(guī)則與否。

1.6.2 革蘭氏染色

參照CB/T4789.28-2013。

1.7 16SrDNA序列的分析及其系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

1.7.1 DNA提取

參照上海生工SK1201-UNIQ-10柱式細菌基兇組DNA抽提試劑盒說明書操作。

1.7.2 PCR擴增細菌的16SrDNA序列

1) 引物序列

正向引物27F：5’-AGACTTTCATCCTGGCTCAG-37；反向引物1492R(1510)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

2) PCR反應體系建立(50μ1)

模板DNA10pmo1，上游引物1μ1，下游引物1μ1，dNTPMix1μ1，10×TaqreactionBuffer5μ1，高保真聚合酶(5U/μ1)0.25μ1，無菌超純水補足至50μ1。

3) PCR程序設定

98℃預變性5min：95℃變性35s，55℃退火35s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；延伸8min。

1.8 種屬鑒定

將PCR產(chǎn)物送到測序公司進行測序。將測序完成的16SrDNA序列在GenBank(NCBI)中進行B1AST檢索，尋找相似序列并下載，用MEGA軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹確定細菌種屬。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)取3次重復平均值，采用Exce1、SPSS18.0、正交設計助手等軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

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