纖維素酶（Cellulase）是一種可降解纖維素生成葡萄糖的酶類，其作為重要的工業(yè)酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織、生物燃料等領(lǐng)域。近年來工農(nóng)及醫(yī)藥業(yè)得到了飛速發(fā)展，但同時也產(chǎn)生了大量的產(chǎn)業(yè)廢棄物，隨著全球環(huán)境污染問題的愈發(fā)嚴(yán)重，這些廢棄物的合理利用已成為當(dāng)前解決環(huán)境問題的焦點，如富含纖維類物質(zhì)的果蔬加工副產(chǎn)物、中藥加工殘渣及農(nóng)作物秸稈等的再利用，利用纖維素酶處理已成為重要的解決途徑之一。纖維素酶的來源廣泛，如網(wǎng)翅目、直翅目、鞘翅目等昆蟲體內(nèi)的消化液，以及微生物的代謝產(chǎn)物等，其中以微生物來源纖維素酶報道最多?？僧a(chǎn)纖維素酶的微生物主要來源于動物及昆蟲的消化道，土壤及泉水、湖水的沉積物，青貯飼料，酒醅和窖泥，以及豆豉、黃豆醬、發(fā)酵茶等傳統(tǒng)發(fā)酵食品，這些微生物主要包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌以及霉菌，其中不可培養(yǎng)的微生物也可能是纖維素酶的重要來源，故研究人員利用宏基因組技術(shù)從環(huán)境中篩選纖維素酶基因，并在可體外培養(yǎng)的大腸桿菌中表達(dá)以獲取性能優(yōu)良的纖維素酶，為纖維素酶的資源挖掘開辟了新途徑。此外，纖維素酶及纖維素酶活性微生物對加工食品的品質(zhì)及活性成分的提取具有重要的改善作用。本文擬從自然環(huán)境及發(fā)酵食品中分離篩選高活性纖維素酶產(chǎn)生菌株并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，旨在豐富纖維素酶活性微生物菌種資源庫，并為發(fā)酵食品生產(chǎn)、富含纖維素類廢棄物的合理利用提供菌種資源，同時也為工業(yè)用菌種的開發(fā)及其理論研究提供數(shù)據(jù)支持。

土壤、發(fā)酵豆制品（納豆、豆豉）被用作篩選纖維素酶活性菌株的樣品來源。共采集5個土壤樣品，命名為1、2、3、4、5，來源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)花草及樹木周圍土壤；納豆W：北海道はまなす食品株式會社；納豆R：株式會社ヤマダイフ一ズプロセシング小樽工場；豆豉F：重慶市永川豆豉食品有限公司；豆豉FS：廣東陽江豆豉有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0g，酵母粉0.5g，氯化鈉1.0g，蒸餾水溶解至100mL，自然pH，121℃滅菌15min。固體培養(yǎng)基加入1.8%～2.0%瓊脂粉；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基：CMC-Na1.0g，蛋白胨1.0g，酵母粉0.1g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.04g，氯化鈉1.0g，瓊脂粉1.6g，蒸餾水溶解至200mL，pH調(diào)至pH7.0～pH7.2，121℃滅菌15min。

1.1.3 主要試劑

剛果紅：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市鑫鉑特化工有限公司；亞硫酸鈉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；苯酚：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：天津市北辰方正試劑廠；檸檬酸：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；羧甲基纖維素鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302-02）：天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DY04-13-43-00（LS-30）壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；ME203E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；BSD-100培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SP-752（PC）紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PB-10酸度計：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；H1650臺式高速離心機(jī)：湘儀集團(tuán)；T100-PCR儀：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離及篩選

稱取5.0g采集樣品，無菌條件下分別接種至50mLLB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，10倍梯度稀釋發(fā)酵液，取適當(dāng)濃度稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，挑取在形態(tài)學(xué)上存在差異的單菌落，進(jìn)一步劃線于LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此重復(fù)直至純化。

將已純化分離菌株分別接種至CMC-Na固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，隨后向長有菌落的CMC-Na固體培養(yǎng)基上加入0.2%剛果紅染液染色30min，再依次用蒸餾水和1mol/LNaCl溶液洗掉染液，周圍可見透明圈的菌落被認(rèn)為具有纖維素酶活性，透明圈與菌落直徑的比值越大，纖維素酶活性則越高。選取纖維素酶活性最高的菌株做進(jìn)一步菌種鑒定。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

選取初篩獲取的纖維素酶活性最高菌株，37℃培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基24h，記錄其菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色觀察其菌體細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2.2 16SrDNA基因序列分析

提取菌株基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行16SrDNA基因序列擴(kuò)增，擴(kuò)增引物及條件參照文獻(xiàn)。正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。PCR擴(kuò)增條件：95℃變性5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，正向引物（10μmol/L）1μL，反向引物（10μmol/L）1μL，DNA模板2μL，ddH2O21μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到華大基因（北京）進(jìn)行測序。菌株的16SrDNA基因序列經(jīng)BLAST比對分析，確定與其親緣關(guān)系最近的屬，并基于16SrDNA基因序列利用MEGA5.1軟件構(gòu)建菌株與該屬內(nèi)模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而確定該菌株的種屬。

1.2.2.3 gyrB基因序列分析

由華大基因合成gyrB基因的PCR擴(kuò)增引物（UP-1和UP-2r）及測序引物（UP-1S和UP-2Sr）。正向擴(kuò)增引物UP-1：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，反向擴(kuò)增引物UP-2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT；正向測序引物UP1S：GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA，反向測序引物UP-2Sr：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)。PCR擴(kuò)增條件：95℃變性4min；98℃10s，62℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，正向引物（10μmol/L）2μL，反向引物（10μmol/L）2μL，DNA模板1μL，ddH2O20μL。

1.2.3 培養(yǎng)條件對菌株纖維素酶活力的影響

依次考察不同發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)纖維素酶活力的影響，包括培養(yǎng)時間（12h、24h、36h、48h、60h、72h）、培養(yǎng)溫度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）、培養(yǎng)基初始pH（pH3.0、pH5.0、pH7.0、pH9.0、pH11.0）和接種量（2%、4%、6%、8%、10%）共4項指標(biāo)。

1.2.4 纖維素酶活性優(yōu)化的正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，針對每個因素分別選取3個水平，以纖維素酶活力為評價指標(biāo)，進(jìn)行L₉（3⁴）正交試驗，從而確定菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳發(fā)酵條件，試驗因素與水平如表1所示。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食品添加劑》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：纖維素酶，3，5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，羧甲基纖維素鈉