2.3茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時表達體系的建立

綜合分析了影響茉莉花原生質(zhì)體分離的主要因素,建立了茉莉花花瓣原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化體系。試驗流程為：以溫室或自然環(huán)境中生長并盛開的茉莉花朵為材料,取其充分展開的花瓣為外植體(圖6-A),用刀片將花瓣切割到足夠纖細且均勻,移至含15G·1^-1纖維素酶,4G·1^-1離析酶和8G·1^-1果膠酶的酶解混合液中,每5m1酶解液可酶解約0.5G花瓣量(圖6-B),酶解5h,過濾收集到的原生質(zhì)體經(jīng)過清洗和沉淀,可獲得明顯的原生質(zhì)體聚集層(圖6-C)。用mmG溶液將收集到的原生質(zhì)體稀釋至濃度為4×105個·m1^-1,按75μG·m1^-1原生質(zhì)體的比例加入含GFP標簽的外源質(zhì)粒dnA,再加入等體積的400G·1^-1PEG溶液,混勻后,室溫誘導約5min,轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體暗處孵育16h后,在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)出綠色熒光信號的原生質(zhì)體(圖6－E),說明含GFP熒光蛋白標簽的質(zhì)?？筛咄繉胲岳蚧ɑò暝|(zhì)體,并得到穩(wěn)定表達。

進一步利用含有轉(zhuǎn)錄因子Js1hY-GFP融合載體,進行目標基因的原生質(zhì)體表達研究。以P35s-GFP空載體為對照,分別轉(zhuǎn)入茉莉花瓣原生質(zhì)體后,通過激光共聚焦顯微鏡掃描檢測它們的亞細胞定位。觀察顯示GFP表達載體轉(zhuǎn)入花瓣原生質(zhì)體后,其細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜等部位均有明顯綠色熒光信號,這與其他植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中觀察到的結(jié)果一致,而轉(zhuǎn)入Js1hY-GFP融合載體的花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)生的綠色熒光信號主要集中在細胞核中(圖7),說明轉(zhuǎn)錄因子Js1hY定位于茉莉花細胞的細胞核中行使功能。

2.4 茉莉花蛋白JssWEET1和JssWEET17的亞細胞定位分析

為檢驗茉莉花來源的蛋白在茉莉花原生質(zhì)體和異源表達體系中的亞細胞定位是否一致,本研究選擇了茉莉花的2個糖轉(zhuǎn)運蛋白家族成員JssWEET1和JssWEET17,采用上述優(yōu)化建立的茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來分析它們的亞細胞分布,同時以擬南芥葉片原生質(zhì)體系統(tǒng)作為對照。由于白色花瓣原生質(zhì)體中不含葉綠體,無法檢測到葉綠體產(chǎn)生的自發(fā)熒光,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,JssWEET1-GFP融合蛋白分布于茉莉花瓣原生質(zhì)體細胞膜上,同時在胞質(zhì)中有明顯的斑點狀分布,而在擬南芥葉肉原生質(zhì)體中JssWEET1-GFP主要以斑點狀分布于細胞質(zhì)中(圖8-A和C)。JssWEET17-GFP在茉莉花瓣原生質(zhì)體和擬南芥葉片原生質(zhì)體中均主要分布于細胞質(zhì)或胞質(zhì)內(nèi)膜系統(tǒng)中(圖8－B和d)。

3 小結(jié)與討論

茉莉花作為一種有重要經(jīng)濟價值的花卉植物,由于其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺少使得其在遺傳轉(zhuǎn)化等方面的研究極其困難,而使用原生質(zhì)體進行瞬時轉(zhuǎn)化則在一定程度上克服了這一障礙。目前,關(guān)于茉莉花原生質(zhì)體制備方法的研究尚未見報道。因此,本研究在借鑒擬南芥原生質(zhì)體制備的基礎(chǔ)上,探索了茉莉花植株上適合分離出原生質(zhì)體的組織器官,系統(tǒng)地改良了其原生質(zhì)體的制備條件和轉(zhuǎn)化條件,獲得了擁有較高數(shù)量和活力的花瓣原生質(zhì)體,并表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)化效果。茉莉花花瓣原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的建立,為茉莉花基因和蛋白的研究提供了快捷且更有針對性的受體材料和實驗平臺,避免了利用其他模式植物瞬時轉(zhuǎn)化體系可能帶來的表達或定位紊亂,使得研究結(jié)果更具說服力。

獲得高質(zhì)量的植物原生質(zhì)體,需要考慮到合適的外植體、酶液組合與濃度、酶解時間和酶液滲透壓等關(guān)鍵因素,幼嫩外植體常是分離原生質(zhì)體的最佳材料,研究表明,盛開的茉莉花花瓣相較于葉片具備組織幼嫩、細胞排列松散等特點,更適合作為原生質(zhì)體游離的材料。本研究還發(fā)現(xiàn)果膠酶對茉莉花花瓣原生質(zhì)體的分離有關(guān)鍵作用,當酶液中缺少果膠酶時游離出的原生質(zhì)體數(shù)量稀少,而在纖維素酶、離析酶和果膠酶同時使用時,原生質(zhì)體產(chǎn)量有明顯改善。經(jīng)綜合分析,本試驗中分離茉莉花瓣原生質(zhì)體的最適宜酶類組合為：15G·1^-1纖維素酶＋4G·1^-1離析酶＋8G·1^-1果膠酶,最優(yōu)酶解時間為5h。

由于可以清晰看見其細胞膜與細胞器,使原生質(zhì)體在蛋白亞細胞定位上更具有優(yōu)勢,利用原生質(zhì)體進行簡易的基因瞬時表達及亞細胞定位是當前研究植物分子與細胞生物學中最常用且高效的方法。本實驗室在研究茉莉花開花過程相關(guān)功能基因時,鑒定到一系列在茉莉花瓣中特異性高度表達的基因,采用已建立的茉莉花瓣原生質(zhì)體表達系統(tǒng),成功鑒定了擬南芥生物鐘調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AT1hY在茉莉花中的同源蛋白Js1hY具有細胞核定位特性。此外,茉莉花的糖轉(zhuǎn)運蛋白家族可能介導跨細胞膜的糖運輸與儲存,其家族多個成員在開花過程中表達量顯著上調(diào),煙草葉片瞬時表達顯示它們多分布于細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)膜中,研究也表明,JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP分別定位于茉莉花瓣原生質(zhì)體的細胞膜和細胞質(zhì)中,同時JssWEET1-GFP還以斑點狀分布于細胞質(zhì)中,猜測其可能通過高爾基體或囊泡等細胞器參與糖分運輸,這些結(jié)果意味著它們介導的生物學功能發(fā)生在不同的細胞器中。在擬南芥葉片原生質(zhì)體中,JssWEET17-GFP的分布與其在茉莉花瓣原生質(zhì)體中的定位基本一致,而JssWEET1-GFP在細胞膜上定位信號較弱,主要以斑點狀分布于胞質(zhì)中,說明其亞細胞分布可能具有組織細胞特異性。

相較于成熟的擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬時表達體系,本研究中茉莉花瓣原生質(zhì)體的活性和轉(zhuǎn)化率還有待提升,不過由于栽培容易、自然盛開的茉莉花瓣容易收集、酶解時間短等優(yōu)點,使得花瓣原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化試驗可在1d內(nèi)完成,有效促進了某些基因功能的研究分析。受限于組織特異性,花瓣原生質(zhì)體中不含葉綠體,所以研究與葉綠體相關(guān)的蛋白或基因可能需要共轉(zhuǎn)化對照質(zhì)粒,未來對茉莉花葉片的原生質(zhì)體分離體系仍需進一步優(yōu)化。

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