2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉花原生質(zhì)體分離體系的優(yōu)化

為了分離到足夠量、有活力的茉莉花原生質(zhì)體,本試驗(yàn)采用酶解法,針對(duì)不同組織器官、不同處理方式、酶解液組合、酶解時(shí)間等因素進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。

2.1.1 不同處理方式對(duì)茉莉花原生質(zhì)體分離的影響

借鑒擬南芥和番茄葉片原生質(zhì)體制備方法,初步嘗試從茉莉花葉片分離原生質(zhì)體,然而得到的原生質(zhì)體多為細(xì)胞碎片,且形狀異常,FDA染色大部分無(wú)熒光,顯示存活率極低(圖1-A,B)。然而,以茉莉花花瓣為試材時(shí),在相同的酶解液中可收集到形態(tài)良好,FDA處理發(fā)熒光,有活力的原生質(zhì)體(圖1-C,D),因此在接下來(lái)的研究中須專注于優(yōu)化茉莉花花瓣的原生質(zhì)體分離體系。

嘗試了用切絲法、膠撕法和磨砂法在酶解前分別對(duì)花瓣組織進(jìn)行處理(圖2-A,B,C),以使花瓣細(xì)胞能充分接觸酶解液。在4m1相同酶解液中孵育6h后,收集觀察原生質(zhì)體產(chǎn)量,在3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)中均顯示切絲法獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多,膠撕法次之,磨砂法得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量最低(圖3)?？紤]到操作的簡(jiǎn)易性,切絲法處理茉莉花花瓣對(duì)原生質(zhì)體分離最有效。

2.1.2 酶液組合和酶解時(shí)間對(duì)茉莉花原生質(zhì)體分離的影響

在含4G·1^-1離析酶和2G·1^-1果膠酶的酶解液中梯度增加纖維素酶的質(zhì)量濃度從5至30G·1^-1,檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4-A),在一定濃度范圍內(nèi),原生質(zhì)體產(chǎn)量隨纖維素酶質(zhì)量濃度提高而增加,當(dāng)濃度為15G·1^-1時(shí),原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到峰值,為1.34×106個(gè)·G^-1,死亡率為29.1％；隨著纖維素酶質(zhì)量濃度繼續(xù)升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都開(kāi)始下降,細(xì)胞破碎程度嚴(yán)重。因此,分離茉莉花花瓣原生質(zhì)體較適宜的纖維素酶質(zhì)量濃度為15G·1^-1。在含4G·1^-1離析酶和15G·1^-1纖維素酶的酶解液梯度增加果膠酶的質(zhì)量濃度從2至10G·1^-1,花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4-B),隨果膠酶濃度升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量同步增加,當(dāng)果膠酶質(zhì)量濃度為8G·1^-1時(shí),原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,為1.48×106個(gè)·G^-1,死亡率較低,為31.0％,較適宜花瓣原生質(zhì)體的分離.試驗(yàn)表明,酶解液中最佳的纖維素酶和果膠酶質(zhì)量濃度分別為15和8G·1^-1。

為進(jìn)一步優(yōu)化茉莉花花瓣原生質(zhì)體的分離效率,選取4個(gè)酶解時(shí)間段3、4、5、6h,采用上述優(yōu)化后的酶解液組合,檢測(cè)釋放出來(lái)的原生質(zhì)體總量及死亡率。如圖4-C所示,隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),原生質(zhì)體產(chǎn)量逐步增多,在酶解5h時(shí),原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,達(dá)到2.96×106個(gè)·G^-1,死亡率為23.5％,相對(duì)較低.因此最適合酶解時(shí)間為5h。

2.2茉莉花原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

本研究進(jìn)一步采用PEG介導(dǎo)法,探討了原生質(zhì)體終濃度、外源dnA含量、不同PEG處理等對(duì)茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響。

將收集的花瓣原生質(zhì)體稀釋成不同終濃度的細(xì)胞液,經(jīng)相同的轉(zhuǎn)化方法和孵育時(shí)間,熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率,結(jié)果如圖5-A所示,相同轉(zhuǎn)化體系中,外源dnA含量為100μG·m1^-1原生質(zhì)體時(shí),最適合轉(zhuǎn)化的茉莉花花瓣原生質(zhì)體濃度為4×105個(gè)·m1^-1,轉(zhuǎn)化效率約78％。

向原生質(zhì)體濃度為4×105個(gè)·m1^-1的轉(zhuǎn)化體系中加入不同量的P35s-GFP質(zhì)粒,經(jīng)相同的PEG處理和孵育時(shí)間,結(jié)果如圖5-B所示,當(dāng)轉(zhuǎn)化體系中dnA含量為75μG·m1^-1原生質(zhì)體時(shí),轉(zhuǎn)化效率最佳,約為79％。

本研究分析了不同終濃度的PEG4000對(duì)茉莉花花瓣原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響(圖5-C)。在終濃度為200G·1^-1的PEG處理下花瓣原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率顯著高于其他濃度,其次是150和250G·1^-1的PEG終濃度,50G·1^-1PEG處理下原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率最低。

為進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系,本試驗(yàn)還比較了PEG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響(圖5-D)。PEG處理時(shí)間在10min以內(nèi),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率均達(dá)到70％以上,當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)15min,轉(zhuǎn)化效率顯著降低。

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