茉莉花是木犀科素馨屬香花植物,可用于茉莉花茶的窨制和香料提取。雙瓣茉莉是我國(guó)茉莉花栽培的主要品種,其花冠筒分為兩輪,花瓣潔白,產(chǎn)量高,花香濃,是窨制茉莉花茶的主要原料,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；植株抗逆性較強(qiáng),易于栽培,也是用于研究的理想材料。獲得可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株雖然是研究植物基因功能的重要手段,但由于耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、轉(zhuǎn)化體系不成熟等因素仍限制著當(dāng)今許多植物品種的分子生物學(xué)研究。瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)結(jié)合報(bào)告基因的使用為研究目標(biāo)基因功能提供了快速、高效的途徑,擬南芥、煙草、番茄、玉米原生質(zhì)體細(xì)胞,煙草葉肉細(xì)胞,煙草BY-2細(xì)胞以及洋蔥表皮細(xì)胞等介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)體系已被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子及蛋白活性檢測(cè)、蛋白互作等基因功能研究分析。現(xiàn)階段植物細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究主要集中在模式植物,在花卉植物上的研究相對(duì)較少。然而,異源受體細(xì)胞對(duì)同一蛋白的表達(dá)效果可能存在差異,為了使目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物正確折疊,修飾并精準(zhǔn)定位于相應(yīng)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),選擇同源植物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)分析可增加研究的準(zhǔn)確性。

前人在茉莉花品種形態(tài)特征、香氣特性和精油提取方面做了大量研究,但關(guān)于功能基因在細(xì)胞水平方面的研究甚少,而關(guān)于茉莉花原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的方法還未見(jiàn)報(bào)道,因此建立茉莉花原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化體系為深入開(kāi)展茉莉花細(xì)胞水平及分子水平的功能基因組研究具有重要意義。本研究通過(guò)酶解法分離到大量有活力的雙瓣茉莉花花瓣原生質(zhì)體,運(yùn)用PEG介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,成功鑒定了3個(gè)茉莉花來(lái)源的目標(biāo)蛋白在原細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,為高通量開(kāi)展茉莉花候選基因的功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

茉莉花供試材料為自然條件下盆栽種植的雙瓣茉莉,取自福建農(nóng)林大學(xué)茉莉花種質(zhì)資源圃。擬南芥供試材料為哥倫比亞生態(tài)型,由本實(shí)驗(yàn)室人工氣候室培育,生長(zhǎng)條件為22℃,光照13h(22℃),黑暗11h,光照強(qiáng)度約80μmol·m^-2·s^-1,濕度60％。擬南芥種子在4℃冷室春化48h后,移至溫室萌發(fā),萌發(fā)后的種子移至蛭石上,定期澆灌1/4hoAG1AnD營(yíng)養(yǎng)液。

1.1.2 質(zhì)粒載體

試驗(yàn)所用載體P35s-GFP來(lái)源于細(xì)胞表達(dá)載體P2FGW7(6666BP),表達(dá)框由花椰菜花葉病毒(CAmＶ)35s啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白(GFP)基因和胭脂堿合成酶終止子(nos)構(gòu)成。質(zhì)粒在大腸桿菌dh5α菌株中擴(kuò)增后,大量提取純化質(zhì)粒dnA,電泳鑒定并測(cè)定質(zhì)粒dnA濃度和純度,D260nm/d280nm＝1.8～1.9,DnA濃度為1μG·μ1^-1,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP載體：Js1hY、JssWEET1和JssWEET17是福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院伍炳華課題組從茉莉花花朵CDnA中利用RACE引物分離克隆到的3個(gè)基因,其中Js1hY屬于mYB轉(zhuǎn)錄因子家族的生物鐘1hY/CCA1的同源編碼基因；JssWEET1和JssWEET17屬于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白sWEET家族的兩個(gè)編碼基因。3個(gè)基因均已亞克隆至細(xì)胞表達(dá)載體P2GWF7(6670BP)的GFP編碼序列的閱讀框5'端,構(gòu)建了Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP載體。

1.1.3 試劑

主要試劑有纖維素酶(CE11ｕ1AsE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、離析酶(mACERoZYmE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、果膠酶(PECTinAsE,siGmA)、牛血清白蛋白(BsA,siGmA)、mEs(siGmA)、PEG4000(siGmA)、二乙酸熒光素(F1ｕoREsCEindiACETATE,FDA,siGmA)、碘化丙啶(PRoPiDiｕmioDiDE,Pi,siGmA)。其余基本試劑均購(gòu)自生工生物公司。

1.2 外植體材料的處理

參照YooETA1的方法,選取生長(zhǎng)5～6周的擬南芥真葉中完全伸展的葉片,或自然盆栽下3年生茉莉花植株的嫩葉,用單面刀片將葉片切成寬約0.5～1.0mm的細(xì)絲,與酶液充分混合后,進(jìn)行原生質(zhì)體分離。

本試驗(yàn)還選用盛開(kāi)的茉莉花花瓣作為分離原生質(zhì)體的酶解材料,并借鑒YooETA1、WｕETA1和ZhEnGETA1的方法,采用不同的處理方式,本文命名為切絲法、膠撕法和磨砂法,比較對(duì)茉莉花花瓣原生質(zhì)體分離效率的影響。選取3～5朵新鮮開(kāi)放的花朵0.1～0.4G,采用不同的處理方式使花瓣細(xì)胞暴露：A切絲法,用刀片將花瓣切成寬度為0.5～1.0mm細(xì)條；B膠撕法,用膠帶紙粘住花瓣正反面,輕輕撕去粘在下表皮上的膠帶,使花瓣細(xì)胞暴露；C磨砂法,用極細(xì)石英砂輕輕摩擦花瓣下表皮,造成表皮輕微磨損暴露出花瓣細(xì)胞。處理后的花瓣組織立即移至酶液中,進(jìn)行原生質(zhì)體分離,每個(gè)處理試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),分別統(tǒng)計(jì)花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性。

1.3 原生質(zhì)體的分離方法

葉片或花瓣原生質(zhì)體的制備方法參照YooETA1的方法,并略做修改,將處理后的植物材料浸泡于含15G·1^-1纖維素酶和4G·1^-1離析酶的酶解液中,酶溶劑為20mmol·1^-1KC1,0.4mol·1^-1甘露醇,20mmol·1^-1mEsPh5.7,10mmol·1^-1CAC12和1G·1^-1BsA的混合液,抽真空處理30min后,在25℃黑暗條件下靜置酶解4h,之后置于水平振蕩器上以200R·min^-1的轉(zhuǎn)速震蕩10min,使原生質(zhì)體充分釋放到酶解液中。向酶解混合液中加入等體積的W5溶液(154mmol·1^-1nAC1,125mmol·1^-1CAC12,5mmol·1^-1KC1,2mmol·1^-1mEsPh5.7),經(jīng)200目紗布過(guò)濾后,于200G,4℃離心3min,棄上清收集原生質(zhì)體,之后再加入2m1的W5,靜置冰上40min,移除上清后,加入2m1W5溶液重懸,測(cè)定原生質(zhì)體總量。

為優(yōu)化茉莉花瓣原生質(zhì)體的分離效率,將切絲法處理后的花瓣組織置于含一定濃度梯度纖維素酶或果膠酶的酶解液中,黑暗條件下酶解3～6h,在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和死亡率,確定適宜的酶液組合和酶解時(shí)間,試驗(yàn)重復(fù)3次。使用熒光染料Pi檢測(cè)原生質(zhì)體的死亡率。向100μ1收集的原生質(zhì)體中加入1μ1Pi溶液(100μG·m1^-1)混勻,取10μ1至載玻片上,在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)一個(gè)視野中發(fā)出紅色熒光信號(hào)的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)和白光視野下原生質(zhì)體的總個(gè)數(shù),觀察視野5～10個(gè),原生質(zhì)體死亡率/％＝(發(fā)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100。

1.4 原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活性測(cè)定

產(chǎn)量測(cè)定：通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。收集的原生質(zhì)體重懸于W5溶液中,取少量滴于0.1mm血球計(jì)數(shù)板上,在光學(xué)顯微鏡下觀察,選取膜結(jié)構(gòu)完整的原生質(zhì)體計(jì)數(shù),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3個(gè)重復(fù),取平均值,統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量。懸浮液中原生質(zhì)體濃度/(個(gè)·m1^-1)＝血球計(jì)數(shù)板平均每個(gè)大方格(0.1mm3,即0.1μ1)的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)×104。原生質(zhì)體產(chǎn)量,即每克鮮重材料所得的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)/(個(gè)·G^-1)＝原生質(zhì)體的濃度(個(gè)·m1^-1)×懸浮原生質(zhì)體的W5溶液體積(m1)/花瓣質(zhì)量(G)。

活性測(cè)定：采用FDA活體染色法。每100μ1懸浮的原生質(zhì)體中加入1μ1FDA染色液(5mG·m1^-1溶解于丙酮),取10μ1置于載玻片上,在熒光顯微鏡下檢查其活性,活力高的原生質(zhì)體在熒光下顯微鏡下可發(fā)出黃綠色熒光。

1.5 原生質(zhì)體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將沉淀后的原生質(zhì)體用mmG溶液(0.4mol·1^-1甘露醇,15mmol·1-1mGC12,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重懸,使其濃度達(dá)到2×105個(gè)·m1^-1,用于PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。每100μ1原生質(zhì)體樣品與10μ1外源質(zhì)粒dnA(1μG·μ1^-1)以及110μ1PEG溶液[400G·1^-1PEG4000,0.2mol·1^-1甘露醇,0.1mol·1^-1CAC12]充分混勻后,室溫靜置5min,加入440μ1W5溶液終止反應(yīng),200G離心棄上清.用100μ1W1溶液(0.5mol·1^-1甘露醇,20mmol·1^-1KC1,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重懸原生質(zhì)體,22℃黑暗條件下培養(yǎng)12～16h,可觀察原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率或目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。

為改善茉莉花瓣原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率,將分離純化后的花瓣原生質(zhì)體重懸成不同濃度的細(xì)胞液,向轉(zhuǎn)化體系中加入不同量的P35s-GFP質(zhì)粒dnA,與等體積的不同質(zhì)量濃度的PEG溶液輕柔混勻,使轉(zhuǎn)化體系的PEG終濃度分別為50、100、150、200和250G·1-1,室溫靜置分別處理2、5、10、15和30min,轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體暗處孵育16h,在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率,試驗(yàn)重復(fù)3次.轉(zhuǎn)化效率檢測(cè):向100μ1轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體加入1μ1Pi溶液,取10μ1至載玻片上,在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)1個(gè)視野中發(fā)出紅色熒光信號(hào)的原生質(zhì)體個(gè)數(shù),表達(dá)綠色熒光蛋白的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)和白光視野下原生質(zhì)體的總個(gè)數(shù),觀察視野5～10個(gè),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率/％＝[發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/(原生質(zhì)體總數(shù)-Pi染色發(fā)紅色熒光的細(xì)胞數(shù))]×100。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞定位

含目標(biāo)基因的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體,孵育16h后,從管底吸取10μ1原生質(zhì)體溶液置于載玻片上,用1EiCATCssP8激光共聚焦顯微鏡觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。用于觀察GFP信號(hào)的熒光激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm,發(fā)射波長(zhǎng)為505～535nm；觀察葉綠體自發(fā)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)為633nm,發(fā)射波長(zhǎng)為647～685nm。

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