3結(jié)果與分析

3.1煙管菌的抗病能力分析

以煙草為寄主，檢驗(yàn)煙管菌對(duì)由灰葡萄孢引起的灰霉病，由鏈格孢引起的赤星病和黑斑病的抑制效果進(jìn)行抗病表型實(shí)驗(yàn)（表3）。結(jié)果表明，在離體和活體條件下，煙管菌能夠使灰霉病病斑面積分別減少91.97%和100%；使赤星病病斑面積減少77.12%和75.03%。而在黑斑病的實(shí)驗(yàn)組中，離體條件下并未觀察到明顯的抗病效果；活體接種病原菌時(shí)，多次重復(fù)未檢測(cè)到明顯發(fā)病跡象。

煙草灰霉病、煙草赤星病和煙草黑斑病分別由灰葡萄孢、鏈格孢和細(xì)極鏈格孢引起煙草葉片的病斑面積測(cè)量后，被用以比較煙管菌對(duì)上述三種病害的抗病能力數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，“*”表示差異顯著（P<0.001）。

3.2生物信息學(xué)分析

對(duì)該菌株的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)煙管菌該菌株具有11個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，12個(gè)β-1，3-糖苷酶基因。其中5個(gè)幾丁質(zhì)酶基因（EVM0010419；EVM0005032；EVM0003995；EVM0003825；EVM0009013）和3個(gè)β-1，3-糖苷酶基因（EVM0006890；EVM0003791；EVM00010135）所對(duì)應(yīng)的蛋白序列N端具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)煙管菌幾丁質(zhì)酶基因的保守結(jié)構(gòu)域分析表明，煙管菌幾丁質(zhì)酶基因均屬于GH18基因家族。此外，EVM0005032和EVM0003825末端帶有Chic_BD（aromaticchitin/cellulosebindingsiteresidues）結(jié)構(gòu)，屬于B類(lèi)幾丁質(zhì)酶（CHIB）。

3.3幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-糖苷酶基因的表達(dá)譜分析

RT-qPCR分析對(duì)峙培養(yǎng)第6d的煙管菌細(xì)胞壁裂解酶基因的表達(dá)水平結(jié)果表明在該階段，多個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，如幾丁質(zhì)酶基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1，3-糖苷酶基因EVM0006890（圖2）。尤其是幾丁質(zhì)酶基因EVM60005032（BaCHIB），在與鏈格孢、茄鏈格孢、灰葡萄孢和尖孢鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，該基因分別上調(diào)表達(dá)27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍（圖2B），但在與鏈格孢蘋(píng)果專(zhuān)化型和細(xì)極鏈格孢相互作用時(shí)，該基因未發(fā)生相應(yīng)的上調(diào)表達(dá)。總體上來(lái)看，除基因EVM0005032外，其它基因上調(diào)的情況主要集中在煙管菌與茄鏈格孢和尖孢鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)中，如基因EVM0009013和EVM0006890在應(yīng)對(duì)茄鏈格孢時(shí)表達(dá)上調(diào)（圖2e，2f）。另外，同屬B類(lèi)幾丁質(zhì)酶基因的EVM0003825僅在與尖孢鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)中出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)（圖2d）。

3.4幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌活性

使用鎳柱對(duì)重組蛋白BaCHIB進(jìn)行了分離純化，在咪唑濃度為80mmol/L時(shí)目的蛋白能被高效洗脫，并在后續(xù)的SDS-PAGE中顯示為單一條帶（圖3）。大小在50～70kD之間，與預(yù)測(cè)分子大小63.6kD相近。對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行活性測(cè)定，在37℃下幾丁質(zhì)酶活性約為17.7U/mg。

對(duì)幾丁質(zhì)酶BaCHIB進(jìn)行抗真菌活性測(cè)試，經(jīng)48h溫育，相較于對(duì)照組，添加BaCHIB的實(shí)驗(yàn)組中，鏈格孢、茄鏈格孢和灰葡萄孢均無(wú)新生菌絲生長(zhǎng)的痕跡，表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制作用。

圖2接種6d后煙管菌預(yù)測(cè)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁裂解酶基因相對(duì)表達(dá)量分析將煙管菌單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照組；A1為鏈格孢；A2為鏈格孢蘋(píng)果專(zhuān)化型；A3為茄鏈格孢；A4為細(xì)極鏈格孢；B灰葡萄孢；F為尖孢鐮刀菌.根據(jù)多重比較結(jié)果，不同字母表示差異顯著（P≤0.05）。

圖3重組蛋白BaCHIB的純化

4討論

本研究通過(guò)離體和活體實(shí)驗(yàn)，證明了煙管菌對(duì)煙草灰霉病和赤星病具有良好的抗病效果。但在煙草黑斑病的離體侵染4d后，煙管菌施用與否對(duì)發(fā)病面積并無(wú)明顯影響，說(shuō)明在離體條件下煙管菌對(duì)煙草黑斑病沒(méi)有抗病效果，而在活體實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)病斑的發(fā)生，該現(xiàn)象可能由于使用的細(xì)極鏈格孢菌株侵染能力較弱，導(dǎo)致侵染后無(wú)感病表型出現(xiàn)。

生防微生物通過(guò)分泌細(xì)胞壁裂解酶抑制病原菌的生長(zhǎng)是其發(fā)揮生防作用的主要機(jī)制之一，如幾丁質(zhì)酶，β-1，3-糖苷酶，脂肪酶和蛋白酶，這些酶體通常在破壞病原體的細(xì)胞壁中起著至關(guān)重要的作用。為了初步探究煙管菌細(xì)胞壁裂解酶在煙管菌抗病中的作用，本研究通過(guò)生物信息學(xué)和RT-qPCR的角度出發(fā)，對(duì)煙管菌部分細(xì)胞壁裂解酶進(jìn)行分析。

GH18家族廣泛存在于原核生物，真核生物乃至病毒中。按照結(jié)構(gòu)域差異可分為兩大類(lèi)：ClassIII（B類(lèi)）和ClassV（A類(lèi)）。其中B類(lèi)幾丁質(zhì)酶含有幾丁質(zhì)或多糖結(jié)合位點(diǎn)，這類(lèi)幾丁質(zhì)酶主要參與真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)吸收，并在線蟲(chóng)和部分真菌寄生昆蟲(chóng)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，該類(lèi)幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)與植物幾丁質(zhì)酶基因相似，而后者通常與寄主植物對(duì)病原細(xì)菌，真菌及線蟲(chóng)的抗性相關(guān)。由此可推測(cè)，煙管菌幾丁質(zhì)酶基因EVM0005032（BaCHIB）和EVM0003825可能在煙管菌對(duì)病原真菌的生物防治中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。

圖4重組幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌活性三角形圖標(biāo)指示瓊脂塊，箭頭圖標(biāo)指示病原真菌新生菌絲。

使用RT-qPCR對(duì)預(yù)測(cè)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶基因和β-1，3-糖苷酶基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析測(cè)定，借此篩選出可能具有抗真菌活性的細(xì)胞壁裂解酶基因。在對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中，多個(gè)基因在接種6d后表達(dá)量上調(diào)，特別是，幾丁質(zhì)酶基因EVM0005032。結(jié)果表明部分植物真菌性病原，如鏈格孢，茄鏈格孢，尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢，能夠直接誘導(dǎo)煙管菌細(xì)胞壁裂解酶基因的表達(dá)。這一結(jié)果與Banani等的研究相似，桃梅奇酵母（Metschnikowiafructicola）菌株AP47在桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）細(xì)胞壁提取物誘導(dǎo)下，其幾丁質(zhì)酶基因MfChi上調(diào)表達(dá)14倍，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)桃子褐腐病的顯著抑制能力。此外，Essghaier等在研究一種嗜鹽菌對(duì)草莓灰霉病的防治過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠分泌多種具有抗真菌活性的酶類(lèi)：幾丁質(zhì)酶，β-1，3-糖苷酶，纖維素酶和蛋白酶；Urbina等在其研究中也發(fā)現(xiàn)橄欖假絲酵母分泌的一種β-1，3-糖苷酶對(duì)蘋(píng)果病原菌擴(kuò)展青霉具有拮抗能力。上述研究為煙管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB具有抗真菌活性的假設(shè)提供了相應(yīng)的依據(jù)。另一方面，同屬于B類(lèi)幾丁質(zhì)酶的基因EVM0003825，僅在煙管菌與尖孢鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而未出現(xiàn)類(lèi)似于BaCHIB在應(yīng)對(duì)多種病原真菌時(shí)的高表達(dá)現(xiàn)象，這一結(jié)果說(shuō)明，幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB可能在應(yīng)對(duì)病原真菌具有一定的特異性。

結(jié)合抗病效果與幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB的誘導(dǎo)表達(dá)分析，表明煙管菌對(duì)植物真菌病害抗病表現(xiàn)與BaCHIB的誘導(dǎo)表達(dá)情況的出現(xiàn)高度同步。如煙管菌對(duì)煙草灰霉病和赤星病具有抗病能力，幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB在與灰葡萄孢和鏈格孢的對(duì)峙培養(yǎng)中出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)；對(duì)煙草黑斑病沒(méi)有顯著的抗病效果，BaCHIB不出現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)表達(dá)。這一結(jié)果為幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB在煙管菌的生物防治中發(fā)揮重要作用提供了又一關(guān)鍵證據(jù)。

通過(guò)真核外源表達(dá)系統(tǒng)，煙管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB能夠被成功表達(dá)和純化。并表現(xiàn)出幾丁質(zhì)酶活性和良好的抗真菌活性。這一結(jié)果驗(yàn)證了幾丁質(zhì)酶BaCHIB具有抗真菌能力在Ahmed等的研究中，綠色木霉幾丁質(zhì)酶在濃度為2.23mg/mL時(shí)，對(duì)尖孢鐮刀菌培養(yǎng)5d后的抑菌能力為45%；而另一種來(lái)自珊瑚球菌的幾丁質(zhì)酶，在濃度為0.15mg/mL和0.75mg/mL時(shí)，對(duì)稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)抑制率分別在40%和10%左右；而來(lái)源于哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶Chit46，在濃度為3.9μg/mL時(shí)，對(duì)灰葡萄孢培養(yǎng)5d后的生長(zhǎng)抑制能力為76%，表現(xiàn)出較上述兩種幾丁質(zhì)酶更為高效的抑菌能力在本研究中，三種病原真菌在0.2mg/mL的幾丁質(zhì)酶溶液中培養(yǎng)2d后，新生菌絲生長(zhǎng)被強(qiáng)烈抑制，證明煙管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB同樣具有較好的抗真菌能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有生防能力的煙管菌BK-1可能是通過(guò)分泌幾丁質(zhì)酶BaCHIB實(shí)現(xiàn)其對(duì)一些植物真菌病害的抑制，但具體的生物防治機(jī)制，仍然需要在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更加深入的研究。

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