1引言

植物真菌病害是造成農產品損耗的主要原因之一，在實際生產中造成了不可估量的經濟損失。病原菌侵染植株后，使農作物局部或整株感病，影響作物生長，嚴重時造成植株死亡，導致農產品產量降低，品質下降。多數病原菌不僅能在作物生長過程中影響植株狀態(tài)，還在農產品的運輸過程中造成產品腐爛變質，是造成果蔬運輸損耗的主要原因。此外，部分真菌病原菌能夠分泌真菌毒素，食用含有真菌毒素的果蔬能夠導致畸胎或誘發(fā)癌癥，威脅人類健康。如多種鏈格孢產生的鏈格孢毒素以及多種曲霉產生的伏馬霉素B。

幾丁質，是由N-乙?；?D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）單體通過β-1，4-糖苷鍵連接的聚合物，也是病原真菌細胞壁的主要成分。在絲狀真菌中，幾丁質和其他葡聚糖含量占細胞壁成分的70%以上，在部分酵母中，幾丁質含量甚至達到細胞干重的10%～20%。幾丁質酶可以通過外切和/或內切水解酶作用將幾丁質裂解為GlcNAc或GlcNAc的可溶性寡聚體。因此，以幾丁質作為分子靶標，通過幾丁質酶的水解作用來實現植物病害防治是植物病害控制的有效途徑。而生物防治因子分泌細胞壁裂解酶，裂解病原真菌細胞壁，也成為生物防治微生物拮抗植物病原真菌的主要機制之一。

煙管菌（Bjerkanderaadusta）屬于非褶菌目，多孔菌科，煙管菌屬。目前，對于煙管菌（Bjerkanderaadusta）的研究主要集中在環(huán)境科學領域，但仍不乏煙管菌對植物真菌病害治理的研究報道。1982年，Dománski發(fā)現煙管菌能夠抑制櫟樹（Quercusrobur）褐腐病的發(fā)生。2011年，Bak等研究發(fā)現了煙管菌對歐美黑楊（Populuseuramericana）干腐病具有防控能力；2015年，汪華等人篩選出一株對水稻紋枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科羅爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）等引起的植物病害具有很好防治效果的煙管菌M-1；2017年，Zhang等人研究發(fā)現煙管菌能夠有效的抑制西瓜蔓枯病菌（Didymellabryoniae），并在2018年首次探究了煙管菌對核盤菌的抑制作用及其對油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum）的防治效果。但目前，仍然缺乏煙管菌生物防治機制研究。本研究結合抗病效果和RT-qPCR分析，首次從煙管菌中篩選并克隆出一個幾丁質酶基因，并通過外源表達證明了該酶的抗真菌活性。推測該基因是煙管菌發(fā)揮生防作用過程中的細胞壁裂解酶基因。

2材料與方法

2.1材料

本氏煙（Nicotianabenthamiana）。

煙管菌（Bjerkanderaadusta）菌株BK-1從四川省馬爾康市土壤中獲得，保藏于本實驗室，ITS序列號為MW182414（NCBI）。鏈格孢（Alternariaalternata）菌株CD-1，鏈格孢蘋果專化型（Alternariaalternataf.sp.mali）L-1，細極鏈格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰葡萄孢（Botrytiscinerea）DY-1均為本實驗室保藏菌種。尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄鏈格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）購自北納生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物見表1及表2。

2.2方法

2.2.1煙管菌抗病能力分析

將灰葡萄孢，鏈格孢和細極鏈格孢轉接到PDA培養(yǎng)基中25℃活化培養(yǎng)7d，使用直徑為5mm的打孔器切取菌絲瓊脂塊作為接種物；煙管菌活化培養(yǎng)7d后，將5個直徑為5mm的煙管菌菌絲瓊脂塊接種至液體的100mLPDB培養(yǎng)基中25℃，180r/min活化培養(yǎng)7d后使用粉碎機打碎，制成煙管菌菌絲懸液作為抗菌液（AntiL）備用。

離體實驗：從生長30d的煙草植株上剪取健康的煙草葉片流水沖洗10min，使用保鮮膜封住葉柄切口處，放置于無菌水浸濕的三層濾紙上，在主葉脈兩側對稱位置分別涂抹50μL無菌水和煙管菌菌絲懸液后接種病原菌菌絲瓊脂塊作為對照組和實驗組，每組6重復。再將葉片和濾紙放入上層開口的塑料盒中，上層使用保鮮膜封口保持盒內濕潤。將其置于溫室內（23℃，16h光照；18℃，8h黑暗），保持48h（細極鏈格孢侵染96h）后對煙草葉片進行拍照記錄。

活體實驗：選取健康的煙草植株，將從上至下第4片葉片作為接種對象，接種方法同離體實驗。將接種后的植株放置在密閉，透光且濕潤的育苗盆內，溫室培養(yǎng)48h（細極鏈格孢侵染96h）后拍照記錄。

上述實驗至少重復兩次，并使用ImageJ進行葉片感病面積統計。

2.2.2生物信息學分析

參考該菌株基因組相關信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），使用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對其幾丁質酶基因和β-1，3-糖苷酶基因進行信號肽預測；并在NCBI數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對幾丁質酶的保守結構域進行比對。

2.2.3對峙培養(yǎng)及RT-qPCR分析

將6種病原真菌和煙管菌接種到PDA培養(yǎng)基中，25℃避光條件下活化培養(yǎng)5d，使用打孔器取各菌落邊緣處直徑為5mm的菌塊。分別將煙管菌和一種病原菌接種到新的PDA培養(yǎng)基中，各距離平板邊緣2cm，并使兩菌塊保持在同一直徑線上25℃避光培養(yǎng)。

使用真菌RNA快速抽提試劑盒（生工），提取對峙培養(yǎng)實驗中接種后第6d相互接觸區(qū)域菌絲的RNA，使用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）進行反轉錄獲取cDNA.以cDNA為模板，以18SrRNA作為參考基因，使用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）試劑盒（擎科）對預測具有信號肽結構的幾丁質酶基因和β-1，3-糖苷酶基因進行表達量測定。

2.2.4煙管菌幾丁質酶基因BaCHIB克隆

使用高保真酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）擴增去除信號肽區(qū)段的幾丁質酶基因BaCHIB-T，并在C端添加6×His蛋白純化標簽。以煙管菌cDNA為初始模板，后續(xù)PCR過程依次使用上一步擴增產物為模板，得到目的片段BaCHIB-T，具體引物如下：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

使用限制性內切酶EcoRⅠ和NotI處理載體pPIC9K.利用同源重組試劑盒（諾唯贊）將BaCHIB-T與線性化的載體同源重組得到重組載體pPIC9K-BaCHIB-T（圖1），測序正確的表達載體使用限制性內切酶salⅠ線性化，醋酸鋰轉化法轉化畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌株。

2.2.5重組蛋白的表達和純化及抗真菌活性

蛋白的表達和純化按照Deng等的方法進行，并進行改進。重組載體的表達菌株經0.5%的甲醇誘導5d，相同處理的空載轉化菌株用于對照組。依次使用含有80，100，120，140mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗脫與柱結合的目標蛋白。目的條帶經SDS-PAGE電泳檢測。幾丁質酶活性測定使用幾丁質酶活性檢測試劑盒（索萊寶）。

純化后的重組蛋白，濃度調整為200μg/mL進行抗真菌活性檢測。從活化5d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰葡萄孢的平板邊緣切取兩塊邊長約為5～10mm的正方形菌絲瓊脂塊，并將其置于2mL離心管中。每管加入400μL純化蛋白溶液作為實驗組，等量蛋白洗脫液作為對照組25℃暗培養(yǎng)48h后，觀察菌絲生長狀況。

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