2.2色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

多種獸藥殘留檢測的流動相一般采用甲醇或乙腈為有機相，實驗按1.5.1節(jié)洗脫程序?qū)?5種藥物和7種內(nèi)標(biāo)物進行測定。結(jié)果表明，以乙腈為有機相時，部分藥物或內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)比甲醇低，回收率也比甲醇差，所以選擇甲醇為流動相的有機相。

H⁺能促進Q1四極桿內(nèi)[M+H]⁺峰的形成，增加化合物在正離子模式下的離子化效率、分離度和響應(yīng)強度；乙酸銨能提高化合物響應(yīng)，改善部分藥物的峰形。本實驗在文獻的基礎(chǔ)上，考察了含不同濃度甲酸、乙酸銨的水-甲醇溶液作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，當(dāng)使用0.1%甲酸水(含0.1mmol/L乙酸銨)-甲醇溶液時，大多數(shù)藥物的峰形、分離度和峰響應(yīng)強度均最佳，但諾氟沙星的回收率大于120%，磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的回收率小于70%。經(jīng)與藥物標(biāo)準(zhǔn)品峰對比發(fā)現(xiàn)，樣品中諾氟沙星-D5、磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的峰面積遠遠低于標(biāo)準(zhǔn)品。向甲醇中加入甲酸，隨著甲酸濃度的增加，上述3種藥物的峰面積逐漸增大，磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的回收率逐漸升高，諾氟沙星回收率降低。但由于正、負離子模式電離原理的區(qū)別，甲酸的加入會抑制負離子模式下化合物電離，導(dǎo)致峰響應(yīng)值降低。為兼顧正、負離子模式同時測定時各藥物的回收率與靈敏度，確定當(dāng)流動相為0.1%甲酸水(含0.1mmol/L乙酸銨)-0.2%甲酸甲醇時，25種藥物回收率均達到最佳，批內(nèi)、批間樣品中各藥物重復(fù)性最優(yōu)，且氯霉素類檢出限均低于GB/T20756—2006要求。優(yōu)化后的實驗條件測定獸藥混合溶液MRM色譜圖示于圖2。雖然大多數(shù)獸藥峰重疊，但分別提取離子對后各物質(zhì)峰形良好。

2.2.2質(zhì)譜條件的選擇

通過針泵以流動注射的方式對1.3節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析，為每個待測藥物選取響應(yīng)較高的2對離子對，為內(nèi)標(biāo)物選取響應(yīng)最高的1對離子對，并優(yōu)化相應(yīng)的去簇電壓和碰撞能作為最初的質(zhì)譜參數(shù)。但在實際樣品測試中，環(huán)丙沙星-D8響應(yīng)最高的離子對峰受雜質(zhì)峰的干擾嚴重，無法準(zhǔn)確積分。以雞蛋為例，其質(zhì)譜圖示于圖3a，部分樣品中雜質(zhì)峰與恩諾沙星響應(yīng)最高的離子對峰完全重疊，造成離子比率遠遠超出允許偏離范圍，二者對定性和定量結(jié)果均有極大影響，通過調(diào)整流動相難以將雜質(zhì)與目標(biāo)物分離。因此，在滿足靈敏度需求的前提下，對恩諾沙星優(yōu)化出第三高響應(yīng)離子對，環(huán)丙沙星-D8優(yōu)化出次高響應(yīng)離子對，示于圖3b，相關(guān)參數(shù)列于表1。

2.3方法學(xué)評價

2.3.1線性范圍和檢出限

根據(jù)每種藥物在儀器上的靈敏度，以空白樣品提取液作為溶劑，將4類藥物配制成一系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的實驗條件下測定，以藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值(y)對被測組分的質(zhì)量濃度(x)作圖，確定25種藥物的線性方程。在空白樣品中加入系列低濃度25種獸藥標(biāo)準(zhǔn)液，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限和定量限，列于表3。25種獸藥在0.2～250μg/L濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r>0.99)，檢出限和定量限分別為0.1～0.9μg/kg和0.3～3.0μg/kg。

2.3.2回收率和精密度

根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，分別添加約1倍(低)、5倍(中)、20倍(高)定量限濃度的25種標(biāo)準(zhǔn)溶液于雞蛋和雞肉陰性樣品中，每個樣品基質(zhì)做6次平行實驗，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表4。4類獸藥的平均回收率為79.5%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～9.2%。

2.4實際樣品檢測

使用本方法檢測實驗室采集的5份雞蛋和5份雞肉樣品，以驗證方法的可行性和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，有1份雞蛋中恩諾沙星含量為3.20μg/kg，氟甲砜霉素含量為31.0μg/kg，另有1份雞蛋中金剛烷胺含量為1.80μg/kg；有1份雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星含量分別為11.3、4.5、14.7μg/kg。采用GB/T21312—2007標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，雞蛋中恩諾沙星含量為3.34μg/kg，雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星含量分別為11.1、4.2、15.5μg/kg；采用SN/T4253—2015標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，雞蛋中金剛烷胺含量為1.5μg/kg；采用GB/T20756—2006標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，雞蛋中氟甲砜霉素含量為28.1μg/kg。其他藥物定性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法一致，表明本方法準(zhǔn)確性較好。

3結(jié)論

本實驗根據(jù)樣品基質(zhì)的特點和4類獸藥的性質(zhì)，對前處理方法及儀器分析方法進行了優(yōu)化，建立了同時提取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法正、負離子模式同時掃描測定雞蛋、雞肉中4類25種獸藥殘留。該方法前處理簡便、高效、回收率高、重復(fù)性好、成本低，一次測定即可完成4種標(biāo)準(zhǔn)方法才能完成的工作量，且對陽性樣品的檢出結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法得到的結(jié)果一致，對多種類獸藥的檢測具有借鑒意義，可為實驗室日常檢測、禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患排查及政府監(jiān)管提供技術(shù)支持。

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