2結(jié)果與討論

2.1前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取試劑的優(yōu)化

本實驗考察了4類獸藥在乙腈和甲醇中的提取效果。結(jié)果表明，甲醇提取的樣品中蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)較多，后續(xù)凈化難度增加且對目標物有較大干擾，大多數(shù)藥物的回收率較差；而乙腈滲透性強，對多數(shù)目標化合物有較高的提取率，且沉淀蛋白質(zhì)效果較好，可以減少強極性雜質(zhì)和弱極性雜質(zhì)的提取，因此選擇乙腈為提取試劑。

2.1.2樣品水解液的優(yōu)化

磺胺類、喹諾酮類藥物在生物體內(nèi)易與蛋白結(jié)合產(chǎn)生較強的結(jié)合力，影響藥物的提取效率。若將乙腈直接加入高蛋白樣品中會導(dǎo)致蛋白質(zhì)急劇變性凝聚，使提取液不能充分接觸藥物，提取效率偏低。但在加入乙腈前先加入一定體積和濃度的酸或堿溶液，可破壞這一結(jié)合力和細胞結(jié)構(gòu)，促使結(jié)合態(tài)藥物解離為游離態(tài)，充分釋放到提取液中，且水解后樣品含水量增加還可減緩蛋白質(zhì)的變性速度，增大提取試劑與藥物的接觸面積，提高藥物的提取效率；另外，酸、堿還可抑制化合物酸、堿基團的解離，提高其轉(zhuǎn)移到乙腈層中的效率。實驗考察了向樣品中加入相同濃度稀鹽酸、氨水、甲酸、磷酸氫二鉀溶液水解后藥物的提取效果。結(jié)果表明，堿溶液水解的雞蛋樣品乳化現(xiàn)象較嚴重，乙腈與基質(zhì)及水相難以分離；而酸水解的分層較好，其中加鹽酸的樣品中大多數(shù)藥物的回收率更高，對鹽酸濃度和體積優(yōu)化后，確定以5mL2mol/L鹽酸水解樣品。

2.1.3鹽析試劑的優(yōu)化

由于水解樣品時帶入大量水而影響提取試劑的濃縮效率。本實驗考察了向提取液中加入過量的無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、碳酸鈉、碳酸氫鈉及氯化鈉以除去水。結(jié)果表明，除氯化鈉外，其余4種均不能使乙腈和水分層，無水硫酸鈉及無水硫酸鎂在本實驗中的使用量不僅不能將水全部去除，還使部分獸藥被吸附而降低回收率。而氯化鈉的鹽析作用可促使水相中的藥物大量轉(zhuǎn)移到乙腈層中，同時提取液中大量蛋白質(zhì)沉淀于水相，避免了提取液濃縮時產(chǎn)生泡沫而溢出的損失。因此，向提取液中加入過量氯化鈉至飽和(約7～9g)，待乙腈和水分層后取出乙腈層再進行后續(xù)實驗。

2.1.4提取次數(shù)的優(yōu)化

本實驗考察了雞蛋、雞肉樣品水解后，每次加入15mL乙腈分別提取1、2、3次后各藥物的回收率，結(jié)果列于表2?？梢?，提取1次部分藥物及相應(yīng)內(nèi)標物的提取效率有較大差異，部分藥物超出獸藥殘留對回收率(70%～120%)的要求；提取2次的回收率最好；提取3次的干擾峰增多。因此，選擇每次加入15mL乙腈重復(fù)提取2次。

2.1.5凈化試劑的優(yōu)化

提取液濃縮至干后，殘留物中有大量油狀物，因此先于提取液中加入8～10mL正己烷除脂后測定。結(jié)果表明，大多數(shù)藥物的回收率高于除脂前，且靈敏度增強，但磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、洛美沙星和培氟沙星的回收率較差。若使用8～10mL環(huán)己烷-正己烷溶液，則磺胺間甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的回收率在70%～120%之內(nèi)，其余藥物的回收率也很好。因此，選擇8～10mL環(huán)己烷-正己烷溶液去除提取液中的脂肪。

此外，部分氯化鈉溶于乙腈中，易對儀器造成污染。由于氯化鈉在乙酸乙酯中的溶解度較小，因此，將樣品提取液濃縮至干后，加入2mL含不同濃度甲酸的乙酸乙酯溶解、過濾，考察對氯化鈉去除效果及藥物回收率的影響。結(jié)果表明，乙酸乙酯溶解后均有大量氯化鈉析出，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾，去除氯化鈉后大多數(shù)藥物的回收率高于去除前，尤其是洛美沙星和培氟沙星，其中以0.2%甲酸-乙酸乙酯溶解的樣品最好。通過計算樣品提取液去除氯化鈉前、后的藥物基質(zhì)效應(yīng)(ME)(ME=空白基質(zhì)標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%)發(fā)現(xiàn)，去除氯化鈉后部分藥物基質(zhì)效應(yīng)大大減弱，示于圖1。由此推測，氯化鈉對藥物回收率有較大影響，選擇0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解殘留物去除氯化鈉。

2.1.6凈化方式的優(yōu)化

樣品中含有色素、糖、有機酸、礦物質(zhì)等多種雜質(zhì)，會減弱色譜柱的性能，影響儀器使用壽命。PSA可有效吸附糖類、色素、有機酸，C18可吸附脂肪和一些礦物質(zhì)等，因此，實驗將C18與PSA混合作為吸附劑，分別采用分散固相萃取法和改良分散固相萃取法(按1.4.2節(jié)操作)對經(jīng)前兩步凈化后的提取液再凈化。結(jié)果表明，由于改良分散固相萃取法中待凈化液與填料接觸更加充分，去除雜質(zhì)效果更好，回收率較高，大多集中在80%～110%范圍內(nèi)。最終選擇C18為30mg，PSA為60mg為吸附劑的改良分散固相萃取法對樣品進行凈化。

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