火龍果屬仙人掌科三角柱屬，原產(chǎn)于墨西哥、中美洲和南美洲，因其健康特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到重視而被廣泛種植。目前，市面上常見(jiàn)的火龍果品種主要有：白肉火龍果、紅肉火龍果和紫紅肉火龍果3種。其中，紅肉火龍果果肉中富含白肉火龍果所缺少的甜菜色素，還含有豐富的不飽和脂肪酸、水溶性食物纖維等。除了有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，紅肉火龍果在抗氧化方面對(duì)人體也有一定的輔助作用。

果實(shí)中有機(jī)酸的組成與含量是影響果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要因素。果實(shí)中存在許多種類(lèi)的有機(jī)酸，然而大多數(shù)果實(shí)通常以1種有機(jī)酸為主，少數(shù)以多種為主。根據(jù)主要有機(jī)酸的種類(lèi)，可以將果實(shí)分為蘋(píng)果酸型果實(shí)、檸檬酸型果實(shí)和酒石酸型果實(shí)等。果實(shí)中的有機(jī)酸代謝是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，由有機(jī)酸的合成和降解共同決定。有研究表明，蘋(píng)果酸是火龍果的主要有機(jī)酸。蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)是蘋(píng)果酸代謝中關(guān)鍵的3個(gè)酶，前兩者催化蘋(píng)果酸的合成，后者則參與蘋(píng)果酸的降解，它們共同調(diào)節(jié)了火龍果生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中蘋(píng)果酸的代謝和積累，其含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，可影響火龍果的風(fēng)味品質(zhì)。

目前關(guān)于紅肉火龍果中蘋(píng)果酸的代謝變化還未見(jiàn)研究報(bào)道。本試驗(yàn)研究了“玫瑰香”品種和“大紅一號(hào)”品種火龍果貯藏過(guò)程中的品質(zhì)變化和蘋(píng)果酸代謝關(guān)鍵基因NADP-ME、PEPC和NAD-MDH的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究紅肉火龍果采后貯藏過(guò)程中蘋(píng)果酸積累的調(diào)控機(jī)制和對(duì)風(fēng)味特性形成的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

“玫瑰香”品種火龍果，采自浙江省江山市秋實(shí)家庭農(nóng)場(chǎng)；“大紅一號(hào)”品種火龍果，采自浙江省諸暨市雪鋒火龍果基地，保鮮車(chē)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于10℃冷庫(kù)中預(yù)冷12h。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀、磷酸、福林-酚等(分析純級(jí))，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈，購(gòu)自美國(guó)迪馬科技公司；草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸及琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于阿拉丁試劑(上海)有限公司；異硫氰酸苯酯、三乙胺、游離氨基酸混標(biāo)，購(gòu)于美國(guó)Sigma試劑公司：PEPC測(cè)定試劑盒。購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

TAXTPlus型質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMS公司：PAL-1型手持折射儀，日本ATAG0公司；877Titrinoplus自動(dòng)電位滴定儀，瑞士萬(wàn)通股份有限公司；UV-9000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司：Waters高效液相色譜儀(型號(hào)e2695-2998配有PDA檢測(cè)器)，沃特世科技(上海)有限公司；微量分光光度計(jì)，日本SHIMADZY公司；恒溫?cái)U(kuò)增PCR儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司：微量核算蛋白測(cè)定儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司：The瑚oMR23i高速低溫冷凍離心機(jī)。法國(guó)捷安特集團(tuán)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

挑選無(wú)機(jī)械損傷，果實(shí)大小和成熟度相對(duì)一致的“玫瑰香”火龍果和“大紅一號(hào)”火龍果。用2％次氯酸鈉浸泡消毒后自然晾干，于25℃恒溫培養(yǎng)，每組3次重復(fù)。分別在貯藏第0，1，2，3，4，5，6。7，8天定期取樣，置于液氮中迅速凍存，混合后分裝至樣品袋中，于-80℃保存。用于后續(xù)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.1 硬度的測(cè)定

參考黃子娟的方法。并稍作修改。采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定火龍果的果皮硬度和果肉硬度，使用直徑2mm探頭(P/2型)，選取火龍果果實(shí)無(wú)鱗片的赤道部位進(jìn)行穿刺測(cè)定，重復(fù)3次，取平均值，單位為N。

1.3.2 可滴定酸含量的測(cè)定

采用可滴定酸自動(dòng)電位滴定儀測(cè)定。果肉勻漿后過(guò)濾，取濾液1mL，用去離子水定容至100mL。以0.05mol/LNa0H溶液滴定，記錄滴定終點(diǎn)時(shí)所用堿溶液的體積，并計(jì)算可滴定酸含量，重復(fù)3次。

1.3.3 可溶性固形物含量的測(cè)

采用手持折射儀測(cè)定樣品可溶性固形物含量，重復(fù)3次。

1.3.4 維生素C含量的測(cè)定

參考吳媛媛等的方法。稱取1g火龍果研磨樣，加入5％TCA溶液，混勻后離心。取上清液依次加入5％三氯乙酸、0.5％鄰菲羅琳-乙醇溶液、0.5％磷酸-乙醇溶液、0.03％三氯化鐵-乙醇溶液和1mL無(wú)水乙醇后于30℃水浴1h。用蒸餾水調(diào)零，以蒸餾水代替上清液為參比。在波長(zhǎng)534nm處測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，單位為mg/100g。

1.3.5 總酚含量的測(cè)定

采用福林酚比色法，參考范智義等的方法，并作適當(dāng)修改。稱取火龍果研磨樣1.0g，加入5.OmL60％乙醇浸提2h，10000×g離心15min，取上清液1mL至25mL具塞試管中，加入3mL1.0mol/L福林酚試劑后搖勻，靜置5min后加入6mL7.5％碳酸鈉，用蒸餾水定容至25mL。室溫下在暗處放置2h，以不加沒(méi)食子酸的樣品為空白，于波長(zhǎng)760nm處測(cè)定其吸光度值，重復(fù)3次，以沒(méi)食子酸含量為標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定總酚含量，單位為μg/g。

1.3.6 可溶性糖含量的測(cè)定

參考曹健康等的苯酚一硫酸法，并作適當(dāng)修改。稱取火龍果研磨樣1.0g，加入5。10mL蒸餾水后封口，于100℃水浴30min。冷卻后過(guò)濾。濾液移入100mL容量瓶，回收殘?jiān)?，加?～10mL蒸餾水于100℃水浴10min后冷卻、過(guò)濾，合并濾液。取500μL樣品液于試管中。加入1.5mL蒸餾水和1.0mL9％苯酚，搖勻，在5～20s內(nèi)加入5mL濃硫酸，搖勻，室溫下反應(yīng)30min，以空白為參比，在波長(zhǎng)485nm處測(cè)定其吸光度值，重復(fù)3次。

1.3.7 有機(jī)酸組分的測(cè)定

1) 色譜條件

C18反相色譜柱(3.9mm×300mm，5μm)；柱溫30℃；流動(dòng)相為0.04mg/LKH2PO4-H3P04緩沖溶液：甲醇=95:5(體積比)；流速0.8mL/min；進(jìn)樣體積10μL；配有PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm；外標(biāo)法定量。

2) 提取方法

用高效液相色譜法，參考關(guān)秀杰等的方法，并作適當(dāng)修改。稱取火龍果研磨樣5.0g于10mL容量瓶，加入一定量流動(dòng)相，于75℃水浴45min，冷卻至室溫，定容。渦旋2min，超聲提取15min，過(guò)濾分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。取一定量濾液，離心10min后用0.45μm孔徑的濾膜過(guò)濾上清液，備用。

1.3.8 NAD-MDH和NADP-ME酶活的測(cè)定

1)酶液提取

參考Masashi等和Hirai等的方法，稍作修改。取5g火龍果研磨樣，加入10mL經(jīng)預(yù)冷的研磨緩沖液(包含10mmol/L異抗壞血酸、0.6mol/L蔗糖、0.2mol，LTris-HCl，pH8.2)，低溫離心后取上清液。用pH8.2的提取緩沖液(包含10mm01/L異抗壞血酸、0.1％曲拉通X-100、0.2mol/LTris-HCl)定容到50mL，混勻后用提取緩沖液定容至100mL，酶液低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2)酶活測(cè)定

NAD-MDH和NADP-ME酶活性測(cè)定參考Hirai等的方法。

1.3.9 PEPC酶活的測(cè)定

使用PEPC測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品中PEPC的酶活。

1.3.10 總RNA提取及檢測(cè)

使用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取火龍果總RNA。取1μLRNA通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值檢驗(yàn)RNA純度，用普通瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性。

1.3.11 RT-qPCR分析

以總RNA為模版，采用諾維贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在冰浴條件下進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。

蘋(píng)果酸代謝相關(guān)基因引物(表1)通過(guò)Primer軟件自主設(shè)計(jì)，檢驗(yàn)引物熔解曲線單一(無(wú)特異性產(chǎn)物)后，可用于實(shí)時(shí)熒光定量分析。

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相關(guān)鏈接：磷酸二氫鉀，異硫氰酸苯酯，福林-酚，富馬酸