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由圖3可知,隨NaCl濃度的升高,溶菌酶的比活力先上升后下降,當(dāng)NaCl濃度為1moL/L時(shí),所得溶菌酶的比活力最高,此時(shí)的洗脫液濃度適宜提取分離溶菌酶。當(dāng)NaCl濃度高于1moL/L時(shí),酶的比活力反而下降,酶含量變化卻不大,可能由于溶菌酶在高濃度鹽溶液中發(fā)生鹽析作用導(dǎo)致。
由圖4可知,當(dāng)洗脫時(shí)間為60min時(shí),所得溶菌酶的比活力最高,隨著洗脫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),酶含量增加緩慢,酶比活力反而下降,綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本,選定洗脫時(shí)間為60min。
綜上,由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,陽(yáng)離子交換法最優(yōu)工藝條件為:蛋清濾液樹脂比為10∶2.5,pH9.0,NaCl(洗脫液)濃度1mol/L,洗脫時(shí)間60min。由此,進(jìn)一步做Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化陽(yáng)離子交換法條件,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。
采用DesignExpert8.0.6軟件進(jìn)行分析,如表3所示。由表3可知,擬合模型的P=0.0014<0.05,說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合良好。根據(jù)以上分析得知溶菌酶比活力R1對(duì)自變量每100mL蛋清濾液中樹脂用量(A)、NaCl濃度(B)、蛋清濾液pH值(C)、洗脫時(shí)間(D)的多元回歸方程為:
R1=20866.66-1432.26A+194.18B+486.75C+539.58D-961.62AB-1252.19AC-2929.88AD-21.46BC-2724.86BD+90.11CD-6079.24A2-5995.65B2-3410.58C2-3903.162。
由方程可知,溶菌酶比活力和4個(gè)自變量之間具有顯著線性關(guān)系?;貧w方程的二次項(xiàng)系數(shù)比較大,交互項(xiàng)系數(shù)中AD、BD的交互系數(shù)很大,說(shuō)明樹脂用量和洗脫時(shí)間、NaCl濃度和洗脫時(shí)間之間的交互效應(yīng)很大,AB、AC的交互系數(shù)較大,說(shuō)明樹脂用量和NaCl濃度之間、樹脂用量和pH值之間交互效應(yīng)較大,而BC、CD的交互系數(shù)比較小,說(shuō)明NaCl濃度和pH值之間、pH值和洗脫時(shí)間之間的交互效應(yīng)小。
為了檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)測(cè)定的溶菌酶的比活力的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,并對(duì)各因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。一次項(xiàng)中A的回歸系數(shù)較顯著,P=0.0806,說(shuō)明蛋清樹脂比對(duì)提取的溶菌酶比活力有較顯著作用。二次項(xiàng)中A、B、C、D的偏回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平。交互項(xiàng)AD、BD回歸系數(shù)較其它因素顯著,說(shuō)明樹脂用量和洗脫時(shí)間、NaCl濃度和洗脫時(shí)間之間的交互項(xiàng)對(duì)溶菌酶比活力影響較為顯著。
為了得到最高的溶菌酶比活力,吸附和洗脫的各條件需要合適的交叉選擇。響應(yīng)面圖可直觀反映各因素及交互作用對(duì)酶活力的影響,故取3項(xiàng)顯著性較高的交互項(xiàng)制作響應(yīng)面圖,根據(jù)圖5~7的Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)擬合響應(yīng)曲面圖和方差分析得知,對(duì)溶菌酶比活力影響大小順序?yàn)锳D>BD>AC。
對(duì)二次回歸方程求一階偏導(dǎo),當(dāng)響應(yīng)值R1(溶菌酶比活力)為最大值時(shí),各因子水平為每100mL蛋清濾液中,樹脂用量(A)為24.20mL、NaCl濃度(B)為1.00mol/L、蛋清濾液pH值(C)為9.10、洗脫時(shí)間(D)為62.61min。此時(shí)理論預(yù)測(cè)溶菌酶比活力為21041.1U/mg。
對(duì)所獲得的陽(yáng)離子交換法各最優(yōu)條件做平行驗(yàn)證試驗(yàn),重復(fù)5次,如表4所示,得到的溶菌酶比活力為20509.58U/mg,與理論值接近。
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