3分析與討論

3.1不同試劑盒對集聚性大腸桿菌基因組的提取效果

分別吸取1 mL培養(yǎng)過夜的集聚性大腸桿菌菌懸液，按照4種細(xì)菌基因組提取試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方法提取集聚性大腸桿菌基因組，不同試劑盒分別提取的集聚性大腸桿菌基因組純度及濃度見表4?；蚪M質(zhì)量濃度在10.8~30.4 mg/L，天根試劑盒提取的基因組DNA的質(zhì)量濃度最低，只有10.8mg/L；寶生物試劑盒提取的質(zhì)量濃度最高，但也僅為30.4 mg/L。純凈的基因組DNA的260 nm處的吸光度A260與280 nm處的吸光度A280的比值1.8，較純凈的基因組DNA的A260與230 nm處的吸光度A230的比值大于2.0，所提取的基因組DNA的A260/A280的值小于1.66，可能樣品有蛋白質(zhì)污染；A260/A230的值小于1.12，推測基因組DNA樣品可能含有有機(jī)試劑或鹽離子等污染物。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。4種試劑盒所提取的基因組條帶完整性良好，無核糖核酸(RNA)污染，但是用4種方法所提取的基因組的濃度均較低。制備核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)前期的基因組樣品提取工作將耗費(fèi)大量的資源，為提高產(chǎn)率，需要對提取步驟進(jìn)行必要的優(yōu)化。從使用4種試劑盒提取EAEC基因組DNA的提取工作耗時(shí)由短到長的順序是寶生物、天根、全式金、OMEGA，其中OMEGA試劑盒提取過程耗時(shí)最長，天根試劑盒提取濃度過低。從試劑盒購買價(jià)格考慮，OMEGA試劑盒（50次）花費(fèi)648.00元，而天根試劑盒（50次）花費(fèi)420.00元；但是該試劑盒需自備RNase A，總費(fèi)用合計(jì)720.00元，在4種試劑盒中價(jià)格最高，因此，后續(xù)研究將對寶生物試劑盒及全式金試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法進(jìn)行優(yōu)化。

3.2寶生物試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

使用寶生物試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法中的革蘭氏陽性菌提取方法，并且增加了對于菌懸液的處理過程。取1 mL培養(yǎng)過夜的EAEC菌懸液，離心分離棄上清后加入500µL的Buffer BS試劑，加入溶菌酶至終質(zhì)量濃度為2 g/L。在第一步的材料處理時(shí)加入蛋白酶K后在56℃的孵育時(shí)間由原來的30 min延長至40 min。

優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的純度及濃度見表5。優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的質(zhì)量濃度為34.1 mg/L，與優(yōu)化前的提取質(zhì)量濃度30.4mg/L相比，濃度提高較少，提取過程耗時(shí)較優(yōu)化前增長了1.5 h，基因組A260/A280及A260/A230的值低于優(yōu)化前。電泳分析結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，優(yōu)化后提取的基因組條帶清晰，無RNA污染，說明優(yōu)化后提取基因組效果未能達(dá)到快速提取大量高質(zhì)量基因組的目的。

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