為了得到一種高效的腸道集聚性大腸桿菌基因組脫氧核糖核酸提取方法，比較OMEGA、天根、寶生物、全式金4種細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸提取試劑盒對(duì)腸道集聚性大腸桿菌基因組脫氧核糖核酸的提取效果，并對(duì)寶生物、全式金試劑盒提取方法進(jìn)行優(yōu)化；測(cè)定所提取的基因組脫氧核糖核酸的純度及濃度，并進(jìn)行基因組完整性檢驗(yàn)及特征基因檢測(cè)。結(jié)果表明，使用全式金細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸提取試劑盒提取腸道集聚性大腸桿菌基因組脫氧核糖核酸時(shí)，通過增加溶菌酶孵育時(shí)長(zhǎng)至40 min，同時(shí)蛋白酶K的用量增加1倍，基因組脫氧核糖核酸提取濃度可提高約14.5倍。

致瀉性腸桿菌是一類重要的食源性病原菌，是細(xì)菌性食物中毒的主要致病菌。腸道集聚性大腸桿菌（EAEC）于1987年被首次分離自一名患有頑固性腹瀉的智利兒童，是一類新型的致瀉性大腸桿菌。EAEC的形態(tài)與一般大腸桿菌無異，為革蘭氏陰性短桿菌，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，無特殊的營養(yǎng)要求。EAEC不侵入腸道上皮細(xì)胞，但能引起腸道液體蓄積，定植于腸道黏膜；不產(chǎn)生熱穩(wěn)定性或熱不穩(wěn)定性腸毒素，也不產(chǎn)生志賀毒素；能分泌腸毒素及細(xì)菌毒素，可誘導(dǎo)黏膜炎癥。由于EAEC能對(duì)Hep-2細(xì)胞形成集聚性黏附，因此也被稱為Hep-2細(xì)胞黏附性大腸桿菌。EAEC感染是發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家暴發(fā)和非暴發(fā)環(huán)境中腹瀉的重要原因，導(dǎo)致兒童及成人急性或持續(xù)性腹瀉。EAEC感染也與沒有腹瀉的兒童營養(yǎng)不良有關(guān)，除了腸產(chǎn)毒性大腸桿菌感染外，EAEC也是旅行者腹瀉的主要原因。EAEC以食物和水為主要傳播媒介，通過糞口途徑傳播，人類普遍易感，成年人的中毒癥狀表現(xiàn)為中度腹瀉，嬰幼兒感染后多表現(xiàn)為2周以上的持續(xù)性腹瀉。目前EAEC已在世界范圍內(nèi)由散發(fā)轉(zhuǎn)為暴發(fā)流行。

食源性致病菌引起的食品安全問題嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全，科學(xué)、快速、準(zhǔn)確的食源性病原菌檢測(cè)是預(yù)防和控制食源性病原菌引起的食品安全問題的重要手段。食源性病原菌檢測(cè)的傳統(tǒng)方法是微生物學(xué)培養(yǎng)鑒定法，操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，特異性不足，靈敏度低。另一種檢測(cè)方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，耗時(shí)短，適用范圍廣。PCR技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相比靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)更短，與其他新興的檢測(cè)技術(shù)相比操作簡(jiǎn)單，成本低，因此得到廣泛的應(yīng)用。目前在我國國家參考物質(zhì)資源共享平臺(tái)上適用于食品微生物檢測(cè)的核酸參考物質(zhì)較少，基本停留在由菌種保藏機(jī)構(gòu)提供純培養(yǎng)物的階段，因此，針對(duì)食源性病原菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)的陽性，對(duì)照或定量標(biāo)準(zhǔn)的基因組脫氧核糖核酸（DNA）參考物質(zhì)較為匱乏的這一現(xiàn)象，建立食源性病原菌檢測(cè)用核酸參考物質(zhì)的快速制備方法尤為重要。

目前，市場(chǎng)上可供細(xì)菌基因組提取的試劑盒多種多樣，但是不同的試劑盒各有特點(diǎn)，適用范圍也各有不同，需要大量制備基因組樣品，并且針對(duì)不同菌株的特點(diǎn)進(jìn)行篩選，甚至是優(yōu)化。本文中通過比較4種細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)EAEC基因組DNA的提取效果，并根據(jù)所得基因組DNA的濃度和純度，對(duì)其中的2種細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行優(yōu)化，以提高EAEC基因組DNA的濃度和純度，為大量制備EAEC核酸參考物質(zhì)提供一種高效的提取方法。

1實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

EAEC菌株菌種保藏號(hào)為CICC24186，其特征基因引物序列如表1所示，特征毒力基因引物參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.6—2016。

1.1試劑與儀器

主要試劑包括：腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基（BHI），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Tris-硼酸（TBE）緩沖粉劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖，北京全式金生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，國藥集團(tuán)；脫氧核糖核酸分子量標(biāo)記D15000+2000，天根生物技術(shù)有限公司；GelStain核酸染料，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

細(xì)菌基因組提取試劑盒包括：OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒（D3350-01）；天根細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302）；全式金細(xì)菌基因組提取試劑盒（EE161-01）；寶生物細(xì)菌基因組提取試劑盒（9763）。

主要儀器包括：立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；雙人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯（北京）有限公司；Eppendorf離心機(jī)，德國埃德本公司；水浴鍋，北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司；制冰機(jī)，北京德天佑科技公司；ThermoNanodrop2000/2000c型超微量紫外分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司；凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)菌培養(yǎng)

稱取腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基干粉24.5g，溶于1 L蒸餾水中，分裝后于121℃高壓滅菌20 min，冷卻后以10 mL/L接種量接種集聚性大腸桿菌，放置于37℃的搖床上以轉(zhuǎn)速為180 r/min培養(yǎng)約12 h。2.2試劑盒法提取細(xì)菌基因組細(xì)菌基因組提取步驟參考試劑盒說明書，提取到的基因組樣品保存溫度為-20℃。

2.3基因組濃度、純度及完整性的檢測(cè)

取1?L提取到的基因組樣品，使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組的純度及濃度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差±s表示。

取2?L基因組樣品與適量的上樣緩沖液混勻后，上樣于含核酸染料GelStain的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠中，以電壓150 V恒壓電泳35 min，緩沖體系采用TBE緩沖液，電泳結(jié)束后，于凝膠成像儀中分析基因組樣品的完整性和純度。

2.4集聚性大腸桿菌特征毒力基因的檢測(cè)

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.6—2016中提供的集聚性大腸桿菌特征毒力基因的引物序列（見表1）合成引物（生工生物工程(上海)股份有限公司），以集聚性大腸桿菌基因組為模板，克隆其特征毒力基因astA、aggR、pic、uidA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增體系如表2所示，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增程序如表3所示。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，取5?L產(chǎn)物，點(diǎn)樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠中，以電壓175 V恒壓電泳25 min，緩沖體系采用TBE緩沖液。電泳結(jié)束后，于凝膠成像儀中觀察聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果。

聲明：本文所用圖片、文字來源《濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)》第35卷第2期，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：大腸桿菌，腸毒素，聚合酶，基因組