溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又被稱為胞壁質(zhì)酶（Muramidase）、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），可以選擇性地水解細菌細胞壁上肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，使得細胞在溶解死亡的同時，不破壞其它組織，是一種天然、安全性能良好的殺菌劑和防腐劑，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，可廣泛應用于食品生物防腐、醫(yī)藥、日用化工等行業(yè)。目前研究表明，雞蛋蛋清是溶菌酶生產(chǎn)的主要原料，其溶菌酶的含量可達到0.2%～0.4%，然而，蛋清中含有多種蛋白質(zhì)，需對蛋清中的溶菌酶進行分離提純。

目前，常用的溶菌酶提純方法包括結(jié)晶法、親和膜色譜法、離子交換法、超濾法等。Curcio等采用靜態(tài)膜結(jié)晶法以NaCl為沉淀劑，MgCl₂溶液為洗脫液，醋酸鈉溶液為緩沖液調(diào)節(jié)蛋清液pH值，靜置1d后溶菌酶以晶體形式析出，其操作簡單，然而生產(chǎn)周期長，原料利用率低，且制得的溶菌酶純度較低。Ho用活性紅120對磁性殼聚糖微球表面進行改性，并采用磷酸鹽緩沖液作為洗脫液，制得的溶菌酶解吸率為92.6%，回收率為89.1%，其制得的溶菌酶純度高，然而操作難度較大，成本高，難以應用于工業(yè)化生產(chǎn)。離子交換法可利用離子交換劑與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力不同起到分離效果。余海芬等采用陽離子交換樹脂法，以硫酸銨為洗脫液提取蛋清溶菌酶，制得溶菌酶比酶活達9500U/mg，其操作簡單，生產(chǎn)周期短，效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。超濾法以超濾膜兩端壓力差為動力，通過控制膜孔徑大小進行蛋白質(zhì)的分離。Mayani等用超濾法所制得的蛋清溶菌酶純品純度達96%，回收率為75%，其操作簡單、快速，相較其它方法條件溫和，是生物工業(yè)領域中較有潛能的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。綜上，現(xiàn)有的溶菌酶提取方法均存在一定的缺陷，因此，本研究協(xié)同使用離子交換法、超濾法，研究一種新型、高效的提純?nèi)芫傅姆椒?，即選用724陽離子交換樹脂對溶菌酶進行特異性吸附，洗脫后經(jīng)二步超濾獲得精制溶菌酶，經(jīng)單因素試驗、Box-Behnken試驗優(yōu)化提純工藝參數(shù)，并對提純后的溶菌酶酶學性質(zhì)進行初步表征。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮雞蛋，市售；溶菌酶標準品，南京建成生物有限公司；溶壁微球菌（MicrococcuslysodeikticusFleming，保藏編號：GＩM1.132），廣東省微生物保藏中心；724大孔弱酸性陽離子交換樹脂，鄭州勤實科技有限公司；蛋白質(zhì)標準品，南京建成生物有限公司；其它試劑均為分析純級試劑。

pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；可見-紫外分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；YXQ-LＳ-18ＳＩ立式壓力蒸汽滅菌器、ＳW-GＪ-1R超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；GXZ-300D生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；DHG-9194A電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取溶菌酶的工藝流程

蛋清攪拌、過濾→樹脂預處理（724大孔弱酸性陽離子交換樹脂提取蛋清液中的溶菌酶，鹽酸、氫氧化鈉溶液的濃度為1mol/L，浸泡時間均為10h）→吸附→洗脫→超濾技術(shù)輔助提純、脫鹽→冷凍干燥得溶菌酶純品。

1.2.2 工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗

以樹脂用量、蛋清濾液pH值、洗脫液濃度、洗脫時間為考察因素，測定洗脫液中溶菌酶質(zhì)量濃度（mg/mL）及比活力（U/mg），并以溶菌酶的比活力（U/mg）為指標考察陽離子交換法的單因素試驗結(jié)果。

1.2.2.2 Box-Behnken試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇樹脂用量（A）、洗脫液NaCl濃度（B）、蛋清濾液pH值（C）、洗脫時間（D）4個因素，每個因素選取低、中、高3個水平（表1），采用4因素3水平的響應曲面方法設計試驗，并以溶菌酶比活力為指標，確定最佳提取工藝。

1.2.2.3 超濾試驗

將陽離子交換法所得到比活力最高的洗脫液，置于不同轉(zhuǎn)速、時間下進行離心超濾（截留分子質(zhì)量為50ku），棄上層液，所得下層液于6500×g，20min離心進行二步超濾（3ku），留上層濃縮液，并以酶含量、比活力為考察指標，探究最優(yōu)超濾條件。

1.2.3 溶菌酶含量及比活力測定方法

1.2.3.1 溶菌酶含量的測定

參考《雞蛋蛋清中溶菌酶的測定分光光度法》（GB/T25879-2010），略有改動。以0.9%NaCl溶液為參比液，在波長281nm處依次測定各溶菌酶標準液吸光度，繪制標準曲線。取試樣1mL，用0.9%NaCl溶液稀釋定容至25mL，混勻，在波長281nm處測定試樣溶液的吸光度，平行測定3次，由標準曲線回歸方程計算試樣的溶菌酶濃度。

1.2.3.2 溶菌酶比活力的測定

參照《溶菌酶活性檢測方法》（GB/T30990-2014），略有改動。于待測管中加入0.4mL待測酶液，再加入2mL溶壁微球菌菌液后開始計時，在波長450nm處分別反應15s和75s后，記錄吸光度A₁₅和A₇₅。按每分鐘較OD₄₅₀值下降0.001為1個活力單位（U）定義，計算酶活力，見式（1）。

式中，E_A—溶菌酶比活力（U/mg）；E_w—所測酶液中溶菌酶含量（mg）。

1.2.4 溶菌酶相對酶活的測定

測定溶菌酶在不同條件下的酶活，計酶活最高值為100%，相對酶活為在不同條件下酶活與最高酶活的百分比。

1.2.5 溶菌酶產(chǎn)品純度鑒定

參照Laemmli等的聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）檢測1.2.1節(jié)中吸附溶菌酶的洗脫液和超濾酶液的純度。電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀采集圖像，ＩmageLab

5.2.1 軟件分析圖像。

1.2.6 蛋清溶菌酶部分酶學性質(zhì)的探究

以1.2.1節(jié)中經(jīng)過優(yōu)化后制得的溶菌酶為樣品酶，探究pH值、溫度、金屬離子、表面活性劑對溶菌酶酶活的影響，以及該酶的溫度和pH穩(wěn)定性。

1.2.6.1 pH值對溶菌酶酶活的影響

使用不同pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20g/mL的酶液，25℃水浴30min后，按1.2.4節(jié)所述方法測定相對酶活（%）。

1.2.6.2 溫度對溶菌酶酶活的影響

使用pH值為7.0的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20g/mL的酶液，水浴加熱至不同溫度（20，30，40，50，60，70，80℃），保溫30min后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.3 溶菌酶的pH穩(wěn)定性

使用不同pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20μg/mL的酶液，并分別反應30，60，90min后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.4 溶菌酶的溫度穩(wěn)定性

使用pH值為7.0的生理鹽水，配制成質(zhì)量濃度為20μg/mL的酶液，水浴加熱至不同溫度（30，40，50，60，70，80℃），保溫30，60，90min后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.5 金屬離子對溶菌酶酶活的影響

用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為20μg/mL的酶液，加入等體積的不同金屬離子（Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺）溶液，使溶液中最終金屬離子含量為0.01mol/L，同時設空白對照，25℃水浴30min后，測定相對酶活（%）。

1.2.6.6 表面活性劑對溶菌酶酶活的影響

使用pH值為7.0的生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為20μg/mL的酶液，等體積加入體積分數(shù)10%的甘油、Tween20、Tween40、Tween80，設空白對照，25℃水浴30min后，測定相對酶活（%）。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert8.0.6軟件響應面設計、數(shù)據(jù)分析、回歸模型建立，采用OriginPro8.0做圖；試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽離子交換法單因素優(yōu)化

2.1.1 樹脂用量優(yōu)化

由圖1可知，當?shù)扒鍢渲葹?0∶2時，溶菌酶比活力達到最大值14997.78U/mg，之后隨著樹脂含量的增加，溶菌酶比活力緩慢下降。而酶含量隨蛋清樹脂比的增加而增加，在蛋清樹脂比到達10∶2.5之后，增加緩慢。由此可知，當?shù)扒鍢渲葹?0∶2.5時，所得溶菌酶的比活力較高，樹脂用量合適，適宜提取分離溶菌酶。2.1.2蛋清濾液pH值優(yōu)化由圖2可知，當?shù)扒鍨V液pH值為9時，溶菌酶比活力最高（16048.71U/mg），當pH值過高或過低時，酶的比活力都會有所降低，可能由于pH值改變了蛋清濾液中酶的帶電狀態(tài)，過酸、過堿都會對酶結(jié)構(gòu)造成不可逆的破壞，使酶的比活力下降。與酶含量達到最高點相比（pH8），pH9時酶含量下降，而比活力卻升高，即陽離子交換法提純蛋清溶菌酶的選擇pH值為9做后續(xù)試驗。

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