羊肚菌是四大名貴食用菌之一，因其菌蓋表面有許多不規(guī)則凹陷且多有褶皺，狀似羊肚而得名，主要分布在云南、貴州、青海、西藏等地。羊肚菌肉質(zhì)鮮美，風味獨特，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖等物質(zhì)，有提高免疫力、抗癌等藥用價值。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單元和人體的所需營養(yǎng)成分，具有多種不同的生理功能，能判斷食品的營養(yǎng)價值，同樣也關聯(lián)和影響食品的風味，是食品質(zhì)量評價的重要指標，所以羊肚菌中氨基酸的含量是衡量羊肚菌品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標。

在國家標準GB/T5009.124-2016中，測定氨基酸采用外標法，吳素蕊、張航、黃世群等對羊肚菌氨基酸的研究多數(shù)均采用外標法，但該方法不能消除實驗中的誤差以及標準品與待測樣品之間的基體差異所導致的基質(zhì)效應，對實驗結果的準確度有一定影響；內(nèi)標法由于內(nèi)標物質(zhì)和待測組分來自同一基體，當實驗條件發(fā)生非人為變化時，兩者會受到相同影響，消除了系統(tǒng)誤差，使分析更加準確。為了更好地評價羊肚菌的品質(zhì)，需對羊肚菌中氨基酸的含量進行全面、準確的控制，但檢測物質(zhì)較多，成本過高且耗時過長。QAMS法通過測定一個成分而實現(xiàn)多個成分的同步測定，大幅度降低成本和實驗人員的工作量，比傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法更加經(jīng)濟、高效、簡單。

本研究采用一測多評法測定羊肚菌中17種氨基酸的含量，并對云南、新疆、貴州等6個不同地區(qū)的羊肚菌測定研究，本文為衡量羊肚菌的食用價值和品質(zhì)優(yōu)劣提供了科學依據(jù)，為羊肚菌的開發(fā)利用指明了方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌采集于新疆伊犁州、云南麗江市、貴州劍河縣、貴州銅仁市萬山區(qū)、貴州貴陽市長坡嶺森林公園、貴州貴陽市烏當區(qū)長坡六個地區(qū)，羊肚菌置于干燥箱70℃烘干后，粉碎處理，過60目篩，粉末密封待用；甲醇、乙腈、三乙胺、正己烷　均為色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；異硫氰酸酯（PITC）純度大于98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸銨、冰醋酸　均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；超純水　自制；18種氨基酸[天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甲硫氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、茶氨酸（The）]　純度均大于98%，北京世紀奧科生物技術有限公司。
Agilent1100高效液相色譜儀（方法學考察所用）、Agilent1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DZKW-電熱恒溫水浴鍋，天津天泰儀器有限公司；200T粉碎機，永康鉑歐五金制品有限公司；AL-104電子天平，梅特勒-托利多公司；CH-250超聲波清洗機，北京創(chuàng)新德超聲電子研究所；DiscoveryDV215CD分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；202-1型恒溫干燥箱　上海實驗儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 內(nèi)標溶液

精密稱取茶氨酸，配制濃度為0.404mg/mL的內(nèi)標溶液。

1.2.1.2 標準品溶液

精確稱取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys等17種氨基酸至10mL容量瓶中，加水定容得到混標儲備液。移取1mL混標儲備液和0.5mL內(nèi)標溶液于5mL容量瓶，加水定容，得到0.0397、0.0496、0.0218、0.0208、0.0078、0.1017、0.0311、0.0447、0.0277、0.0182、0.0207、0.0061、0.0184、0.0263、0.0170、0.0181、0.0446mg/mL的混合氨基酸標準溶液。

1.2.1.3 衍生化試劑

衍生試劑A：取1.4mL1mol/L的三乙胺溶液至10mL容量瓶，用乙腈定容，搖勻；衍生試劑B：吸取125μLPITC至10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品溶液制備與衍生化

1.2.2.1 樣品溶液與空白溶液制備

準確稱取20mg羊肚菌于安瓿瓶中，加6.0mol/L的HCl溶液2mL，吹入氮氣后密封，將其置于（105±5）℃恒溫干燥箱中24h，使氨基酸完全水解。取出冷卻后置80℃水浴揮干，多次加水揮發(fā)鹽酸。加1mL蒸餾水溶解，超聲后得到樣品溶液。將0.5mL的內(nèi)標溶液和樣品溶液移加至5mL容量瓶，加水定容，得到樣品供試溶液，等待衍生。吸取0.5mL的內(nèi)標溶液加至5mL容量瓶，加水定容，得空白溶液。

1.2.2.2 氨基酸的衍生化

精密吸取200μL的氨基酸標準溶液（或樣品供試溶液、空白液）于離心管中，加入衍生試劑A、B各100μL，置40℃水浴鍋中反應1h，加入400μL正己烷，振蕩靜置10min。取澄清的下層液，過0.45μm濾膜，即得待測樣品。

1.2.3 色譜條件

分離柱為依利特HypersilODS2（5μm，250mm×4.6mm）；流動相A：0.05mol/L乙酸銨溶液（pH6.5）；流動相B：乙腈；梯度洗脫（0min，0.8%B；14min，5%B；16min，6%B；16.1min，4%B；21min，4%B；21.1min，3.5%B；30min，3.5%B；32min，8%B；40min，15%B；40.1min，16.5%B；44min，16.5%B；44.1min，20.8%B；50min，23%B；60min，25%B）；流速為1mL/min；檢測波長為254nm；柱溫為35℃；進樣量為5μL；
1.2.4一測多評方法學考察

1.2.4.1 線性考察

精確吸取0.25、0.5、1、2、4mL的混標儲備液，分別置于5mL容量瓶，再分別加入0.5mL內(nèi)標溶液，加水定容，搖勻，進行衍生化處理，按上述的色譜進樣測定。以氨基酸對照品的濃度（mg/mL）為X軸，峰面積為Y軸進行線性回歸

1.2.4.2 相對校正因子的計算

平行取混合標準溶液6份，進行衍生化處理，按上述的色譜條件測定。以Glu為內(nèi)參物，根據(jù)相對校正因子（RCF，f_km）公式fkm=（C_k×A_m）/（C_m×A_k），計算相對校正因子，式中C_k、C_m為內(nèi)參物和待測成分的濃度，A_m、A_k為內(nèi)參物和待測成分的峰面積。

1.2.4.3 精密度試驗

精密吸取混合標準品溶液，進行衍生化處理后按上述的色譜條件連續(xù)測定6次，記錄17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD值以評價儀器的精密度。

相關鏈接：纈氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，冰醋酸

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