釀酒酵母是公認的有益于人類的真菌，在營養(yǎng)條件充足的情況下它進行有絲分裂，此時的酵母以營養(yǎng)態(tài)細胞狀態(tài)存在。但是，在碳源或氮源等營養(yǎng)條件匱乏的情況下，釀酒酵母為了傳宗接代，會進行減數(shù)分裂，產(chǎn)4個孢子包裹于子囊中。營養(yǎng)態(tài)酵母細胞壁有兩層，分別是內(nèi)層葡聚糖層和外層的甘露糖蛋白層。酵母孢子壁有4層，從內(nèi)到外依次是甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。二酪氨酸層是酵母孢子壁特有的結(jié)構(gòu)，其單體是由兩個甲基酪氨酸分子構(gòu)成。這種特殊的孢子壁結(jié)構(gòu)能幫助減數(shù)分裂后的細胞核抵御嚴酷的大自然環(huán)境，等待適宜的生長環(huán)境，從而發(fā)芽成長，再次成為營養(yǎng)細胞形態(tài)，維持酵母的繁衍。

巨噬細胞屬于免疫細胞的一種，能夠吞噬和降解外源顆粒以及微生物并激活免疫反應(yīng)。巨噬細胞的吞噬過程依賴于細胞表面的模式識別受體，該受體能夠識別微生物表面保守的分子模式并且激活受體上酪氨酸基序。被激活的ITAM序列進一步招募脾酪氨酸激酶啟動巨噬細胞的吞噬過程。Svk信號能夠激活諸如磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶等下游信號，從而增加吞噬效率。吞噬過程中，較大顆粒(＞2μm)吞噬依賴于P13K的活性。巨噬細胞對微生物表面分子模式的識別是啟動直接吞噬的第一步。微生物表面的糖鏈結(jié)構(gòu)的特殊性使其被巨噬細胞所識別從而引起吞噬。

自然條件下，多數(shù)酵母處于營養(yǎng)細胞態(tài)。營養(yǎng)態(tài)酵母壁的葡聚糖成分能夠被巨噬細胞表面葡聚糖受體識別從而引起吞噬，促進巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的釋放，葡聚糖也能夠與細菌結(jié)合從而抑制細菌在胃腸道增殖從而達到抑菌的作用。營養(yǎng)態(tài)酵母壁的幾丁質(zhì)成分也能刺激巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α和IL-6，并且增強巨噬細胞對假絲酵母的殺傷作用圈。營養(yǎng)態(tài)酵母壁上這些免疫活性物質(zhì)的存在使得營養(yǎng)態(tài)酵母作為飼料添加物能夠增強牛和豬的免疫力。
釀酒酵母雖為與人類共生的真菌，但目前其子囊孢子形態(tài)對免疫系統(tǒng)的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖層被殼聚糖層和二酪氨酸層嚴密包裹。其免疫活性物質(zhì)未知。作者以小鼠RAW264.7細胞作為巨噬細胞模型，研究了巨噬細胞識別和吞噬酵母孢子的作用機制，為后續(xù)探究野生型酵母孢子免疫作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

作者使用高效產(chǎn)孢率的AⅣJ2D二倍體釀酒酵母菌株，以及ditl△和hs3△突變體菌株，均來自作者所在實驗室保藏菌株，相關(guān)信息見表1。

1.2 細胞及培養(yǎng)

RAW264.7小鼠巨噬細胞，購自中科院菌種保藏庫，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為5％CO2，37℃。

1.3 培養(yǎng)基

YPAD培養(yǎng)基：蛋白胨A10g，酵母提取物5g，腺嘌呤15mg溶解于450mL去離子水中，滅菌后加入50mL質(zhì)量濃度為20g/dL的葡萄糖混勻。固體培養(yǎng)基則加入瓊脂(Agar)10g一起滅菌，之后加入葡萄糖混勻，倒平板。

YPAce培養(yǎng)基：蛋白胨A20g，酵母提取物10g，腺嘌呤30mg，醋酸鉀10g溶解于lL去離子水中，高壓濕熱滅菌。
KAc培養(yǎng)基：稱取20gKAc溶于1L去離子水中，固體培養(yǎng)基加入20g的瓊脂粉，高壓滅菌，倒平板。

1.4 主要試劑和儀器

主要試劑有：DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，昆布糖(Sigma)，葡聚糖微球(Sigma)，PBS(生工)，胰蛋白酶(生工)，蛋白酶K(Sigma)，溶菌酶(Sigma)；主要儀器有：細胞培養(yǎng)箱(Thermo)，離心機(Takara)，顯微鏡(日立)等。

1.5 酵母培養(yǎng)

酵母菌株于固體YPAD平板劃線培養(yǎng)3d后，用粗頭牙簽接種于5mLYPAD液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接于100mL液體YPAD培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5h，使酵母處于對數(shù)生長期并且0D₆₆₀為0.6～0.8，此時收集營養(yǎng)態(tài)酵母，用0.5％吐溫-20洗3次后再用去離子水洗3次，3000r/min離心，稱質(zhì)量備用。酵母孢子的制備：營養(yǎng)態(tài)酵母過夜培養(yǎng)后，取10mL轉(zhuǎn)接到200mL的YPAce培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h后離心轉(zhuǎn)移到2％KAc培養(yǎng)基后續(xù)培養(yǎng)2d；離心收集子囊酵母，當產(chǎn)孢率大于95％時，離心收集菌體，PBS洗2次，加入5mL原生質(zhì)體溶液(1.2mol/L山梨醇，0.1mol/LPBS)和50μL(10OOOU/mL)溶菌酶，于25℃搖床處理3h；原生質(zhì)體溶液洗2次，去離子水洗2次，加入5mL去離子水超聲20min(45％功率，超聲5s，停2s)，用0.5％吐溫-20洗3次后再用去離子水洗3次。顯微鏡觀察孢子純化效果，將純化后孢子制備成100mg/mL的孢子懸液。

1.6 巨噬細胞培養(yǎng)和吞噬實驗

RAW264.7小鼠巨噬細胞置于含10％滅活牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，用含EDTA的胰酶消化后傳代。12孔板每孔接種5×10⁵個細胞，培養(yǎng)24h后，每孔加入相同質(zhì)量的營養(yǎng)態(tài)酵母或者酵母孢子，每組設(shè)置5個平行，1300r/min離心3min，使酵母落到細胞表面，后續(xù)培養(yǎng)30min，PBS洗3次，胰酶消化收集細胞于離心管，4％多聚甲醛同定10min，PBS洗3次。顯微鏡鏡檢并統(tǒng)計每100個巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母或孢子的個數(shù)。

用培養(yǎng)基將母液濃度為10mmol/L的Svk抑制劑白皮杉醇稀釋為25μmol/L或50μmol/L的工作濃度；用培養(yǎng)基將母液質(zhì)量濃度為lmg/mL的P13K抑制劑渥曼青霉素稀釋為100ng/mL或200ng/mL。進行抑制實驗時，細胞接種于12孔板培養(yǎng)24h，更換為含有白皮杉醇或渥曼青霉素的培養(yǎng)基并于37℃孵育30min，加入1mg營養(yǎng)態(tài)酵母或lmg酵母孢子或200μg葡聚糖微球，離心并后續(xù)培養(yǎng)30min，統(tǒng)計相對吞噬效率。

1.8 無血清吞噬實驗

營養(yǎng)態(tài)酵母或孢子與巨噬細胞共培養(yǎng)前，更換不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基或含有10％血清的培養(yǎng)基處理2h，隨后更換為處理組對應(yīng)的培養(yǎng)基并分別加入lmg的營養(yǎng)態(tài)酵母或酵母孢子，l300r/min離心2min后共培養(yǎng)30min，統(tǒng)計吞噬效率。
1.9高鹽以及蛋白酶處理對孢子吞噬效率的影響

野生型酵母孢子經(jīng)高鹽(0.6mol/LNaCl或1mol/LPBS)洗滌后，去離子水洗3次，離心稱質(zhì)量。蛋白酶處理野生型酵母孢子時，取野生型酵母孢子100mg，按照以下反應(yīng)進行：50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/LCaCl₂，加入200μL蛋白酶K(600U/mL)，于37℃處理1h。之后用0.5％吐溫-20洗滌3次，去離子水洗滌3次，超聲30s，制備成100mg/mL的孢子懸液。比較處理組與未處理組吞噬效率。

相關(guān)鏈接：腺嘌呤，蛋白胨，蛋白酶K，胎牛血清

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