口服藥物給藥方式簡(jiǎn)單，不損傷皮膚和黏膜，無交叉感染。是目前藥物療法最常用的給藥途徑。然而，藥物在胃、腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性極大地限制了藥物的利用率。許多藥物仍需以注射的方式給藥。如何提高藥物的口服利用率，構(gòu)建口服藥物載體。仍是現(xiàn)階段亟待解決的問題。近年來提出的納米載藥體系主要是利用具有一定特性的納米載體，將藥物包裹入內(nèi)，提高其穩(wěn)定性和利用率，現(xiàn)已成為國內(nèi)外藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)圈。為了防止藥物進(jìn)入腸道之前在胃中分解,納米口服藥物載體的構(gòu)建需要考慮胃、腸道pH值的變化，使用對(duì)pH值敏感的載體系統(tǒng)。殼聚糖一巖藻聚糖硫酸酯納米載體系統(tǒng)是常用的活性物質(zhì)運(yùn)載體系。殼聚糖是一種天然陽離子多糖，具有良好的安全性、生物相容性、pH值敏感性，可以通過增強(qiáng)細(xì)胞旁路的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)藥物的吸收利用，這使其在口服藥物領(lǐng)域具有一定優(yōu)勢(shì)。巖藻聚糖硫酸酯是褐藻和海洋無脊椎動(dòng)物中常見的硫酸化多糖，含有大量的硫酸基團(tuán)，可與帶正電的殼聚糖通過聚電解質(zhì)自組裝的方式形成納米粒子。巖藻聚糖硫酸酯自身具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種活性，進(jìn)入體內(nèi)后不僅很少引起副反應(yīng)，而且還可以輔助所運(yùn)載的活性物質(zhì)發(fā)揮作用。是一種良好的載藥納米粒子構(gòu)建材料。據(jù)報(bào)道。殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子已作為多種生物活性物質(zhì)的運(yùn)載體，如生長因子、抗腫瘤藥物等。Pinheiro等采用自組裝法制備殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子，用其運(yùn)載生物活性物質(zhì)；Huang等將封裝有堿性成纖維細(xì)胞生長因子的殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子應(yīng)用于神經(jīng)組織工程；Huang等將制備的殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子用于抗腫瘤藥物姜黃素的運(yùn)載，增加了姜黃素的生物利用度。目前，納米粒子的制備多采用商品化的海帶、墨角藻等來源的巖藻聚糖硫酸酯，對(duì)于其它褐藻來源的巖藻聚糖硫酸酯的研究較少。本文從常見、易得的大型海藻羊棲菜中提取得到巖藻聚糖硫酸酯。制備新型殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子，測(cè)定不同巖藻聚糖硫酸酯/殼聚糖比例的納米粒子在人工胃、腸液中的穩(wěn)定性，尋找適用于運(yùn)載口服藥物的新型殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜購于浙江溫州?；⒑Ｔ屦B(yǎng)殖有限公司。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(重均分子質(zhì)量分別為21.1，47.1，107，200，344，708ku)，美國Flu-ka公司；10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮和標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白，美國Sigma公司；乙腈(色譜純級(jí))，美國Tedia公司；殼聚糖(脫乙酰度80％～95％)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。
Agilent1260高效液相色譜儀、AglientElipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，美國Agilent公司；ShodexohpakSB-804HQ高效凝膠滲透色譜柱，日本Shodex公司；InfiniteM200PR0酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；800Y高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；超聲波破碎儀，德國Bandelin公司；Brookhaven粒度儀。美國布魯克海文儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯的提取

羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯的提取參照Silchenko等和劉雪等的方法。將新鮮羊棲菜洗凈，40℃干燥72h，粉碎。取適量藻體粉末。95％乙醇脫脂(料液比1:30)，室溫?cái)嚢?4h。脫脂后進(jìn)行提取，提取條件：2％CaCl₂溶液，料液比1:30，60℃提取3h。提取完畢后，冷卻離心，收集上清液，超濾濃縮，截留分子質(zhì)量100ku。液體濃縮至原體積的1/10，加入4倍體積95％乙醇，醇沉，沉淀經(jīng)無水乙醇脫水、烘干后得到羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯，命名為SFP。

1.2.2 分子質(zhì)量測(cè)定

多糖分子質(zhì)量的測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC法)。色譜條件：ShodexohpakSB-804HQ分析柱(7.6mm×300mm)；流動(dòng)相為0.1m01/LNa₂S0₄；流速0.5mUmin；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)器采用示差折光檢測(cè)器。以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，保留時(shí)問為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

1.2.3 單糖組成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定SFP的單糖組成。多糖完全酸水解：準(zhǔn)確稱取2mg樣品，加入1mL三氟乙酸(2mol/L)，110℃降解6h，去除多余三氟乙酸，得到完全酸水解的樣品。多糖PMP衍生：多糖降解產(chǎn)物及單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶于100μL蒸餾水中，隨即加入100μLNaOH溶液(0.3mol/L)及120μLPMP甲醇溶液(0.5mol/L)，70℃水浴反應(yīng)100min。反應(yīng)結(jié)束后加入100μLHCl溶液(0.3mol/L)中和，二氯甲烷萃取3次，上層液體經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。色譜條件：AgilentEclipseXDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為CH₃CN：PBS(磷酸鹽緩沖液，pH6.7)=17:83(體積比)；進(jìn)樣量10μL；柱溫35℃；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長254nm；流速1.0mL/min。

1.2.4 理化性質(zhì)分析

SFP的總糖含量、蛋白質(zhì)含量四、硫酸基含量、糖醛酸含量圈分別按照相應(yīng)的文獻(xiàn)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 殼聚糖-巖藻聚糖硫酸酯納米粒子(Cs-FucNPs)的制備

配制1mg/mL的殼聚糖(Cs)溶液(0.2％醋酸溶液溶解)和巖藻聚糖硫酸酯(Fuc)溶液(蒸餾水溶解)。采用聚電解質(zhì)自組裝方法制備納米粒子，按照不同的Fuc/Cs體積比(0.6:1，0.8:1，1:1，1.2:1，1.4:1)將殼聚糖溶液滴人巖藻聚糖硫酸酯溶液中，同時(shí)使用超聲波破碎儀(每開啟15s，暫停10s，共40s)混合，得到納米粒懸浮、液。

1.2.6 Cs-FucNPs的理化性質(zhì)

采用Br00khaven粒度儀測(cè)定納米粒子的粒徑、Zeta電位和多分散系數(shù)(PDI)。巖藻聚糖硫酸酯復(fù)合率(Fuc復(fù)合率)：參考文獻(xiàn)的方法，納米粒子溶液經(jīng)14000r/min離心15min后取上層清液0.5mL，加入0.5mL蒸餾水，混勻。繼續(xù)加入0.5mL亞甲基藍(lán)溶液(0.4mmol/L)，混勻，放置5min，于波長560nm處測(cè)定吸光度。

Fuc復(fù)合率(％)=(Fuc₀-Fuc_上清)/Fuc₀×100(1)

式中，F(xiàn)uc-納米粒子溶液中巖藻聚糖硫酸酯的總量，mg；Fuc_上清-離心后上清液中巖藻聚糖硫酸酯的總量，mg。

1.2.7 Cs-FucNPs的體外模擬消化穩(wěn)定性研究

1.2.7.1 體外消化液配

制模擬過程中使用的人工胃液和人工腸液按照王忠元等的方法配制。

1)模擬胃液的配制

按照《中國藥典》2015年版第4部，取稀鹽酸16.4mL，添加約800mL水與10g胃蛋白酶，搖勻使其充分溶解后，調(diào)節(jié)pH值至1.3，加水稀釋定容至1000mL，即為人工胃液。

2)模擬腸液的配制

按照《中國藥典》2015年版第4部，取磷酸二氫鉀6.8g，加500mL水使其溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另外稱取10g胰蛋白酶加適量水溶解，將兩液混合后，加水定容至1000mL，即為人工腸液。

1.2.7.2 體外模擬消化

化取制備好的納米乳液15mL于50mL滅菌離心管。加入模擬胃液15mL(37℃預(yù)熱)，置于恒溫振蕩器(37℃)中，分別在0，1，2，4，6h取出3mL反應(yīng)液，在100℃水浴中滅酶，4000r/min離心10min，取離心后溶液2mL測(cè)定上清液中納米微粒的粒徑、Zeta電位、PDI等指標(biāo)。剩余溶液經(jīng)14000r/min離心15min后，取上清液測(cè)定Fuc復(fù)合率。上步反應(yīng)全部結(jié)束后，取剩余樣液，用0.1mol/L碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至6.8。向管中繼續(xù)加入腸液15mL(37℃預(yù)熱)，置于恒溫振蕩器(37℃)中，分別在0，1，2，4，6h取出3mL，在100℃水浴中滅酶，4000r/min離心10min后取2mL上清液測(cè)定其中納米微粒的粒徑、Zeta電位、PDI等指標(biāo)，剩余溶液經(jīng)14000r/min離心15min后按上述方法取上清液測(cè)定Fuc復(fù)合率。

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