殼聚糖是一種海洋來(lái)源的相對(duì)分子質(zhì)量小于3000的低聚糖。目前，殼寡糖大都通過(guò)化學(xué)法(包括酸解法和氧化法)、物理法以及酶解法(纖維素酶吲或殼聚糖酶)降解得到。基于殼聚糖酶的專(zhuān)一性與高效性，用其制備殼寡糖的方法具有良好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

COS相對(duì)分子質(zhì)量低的特性不但改善了其原料水溶性差的問(wèn)題.同時(shí)其也具有廣泛的生物功能，包括抗炎、抗菌閉、抗氧化、降糖同及神經(jīng)保護(hù)等。近年來(lái)，針對(duì)COS抗腫瘤活性的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

研究表明，在多株腫瘤細(xì)胞(胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等)中，COS均能達(dá)到半數(shù)致死的效果。相對(duì)分子質(zhì)量和去乙酰度影響其抗腫瘤活性，且低相對(duì)分子質(zhì)量表現(xiàn)出更為明顯的效果。在作用機(jī)制探索方面，COS可通過(guò)誘導(dǎo)HeLa和A549細(xì)胞的自噬性死產(chǎn)而抑制細(xì)胞增殖，對(duì)A549細(xì)胞，COS還可明顯降低細(xì)胞線粒體膜電位水平而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，COS可通過(guò)上調(diào)p21，下調(diào)PCNA、cyclinA和cdk-2基因抑制HepG2細(xì)胞的DNA合成速率，抑制細(xì)胞增殖；通過(guò)誘導(dǎo)SW480細(xì)胞阻滯在G2/M期而抑制細(xì)胞增殖。由此可見(jiàn)，COS對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的作用和機(jī)制并不完全相同，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用還有待進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步了解COS潛在的抗腫瘤作用，首先以殼聚糖酶酶解法自行制備COS，建立基于分級(jí)處理的COS優(yōu)化制備工藝，將獲得的低相對(duì)分子質(zhì)量COS產(chǎn)物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)初篩，進(jìn)而在作用最為顯著的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行量效關(guān)系評(píng)價(jià)及初步機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖酶：由作者所在實(shí)驗(yàn)室白行構(gòu)建的重組菌EcoliRosetta-gami(DE3)/ChiE發(fā)酵產(chǎn)酶，經(jīng)純化濃縮后得到殼聚糖酶酶液，酶活為2260U/mL；COS、氨基葡萄糖、無(wú)水乙醇、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、冰醋酸、Tris：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司：鹽酸阿霉素：購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司：DMEM、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、抗生素、胰酶、Dulbecc0’sPhosphateBufferedSaline(DPBS)：購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；納濾膜：購(gòu)于美國(guó)陶氏化學(xué)公司；Transwell小室、CellCountingKit-8(CCK-8)試齊0盒：購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司。
質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％的膠體COS溶液：取1gCOS粉末加入少量去離子水溶脹，加入30mL的0.4mol/L的乙酸溶液攪拌至COS粉末完全溶解，再以2mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，加水定容至100mL。

DNS試劑：準(zhǔn)確稱(chēng)取244.4g酒石酸鉀鈉加到500mL煮沸的蒸餾水中溶解，然后依次加入3，5-二硝基水楊酸6.3g、NaOH21g、苯酚5g和亞硫酸氫鈉5g，攪拌至溶解后定容至1L，棕色瓶中貯存，一周后可使用。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)：上海Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)：上海尤尼可儀器有限公司產(chǎn)品：數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇區(qū)富華電器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)問(wèn)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)ThermoFisher公司產(chǎn)品；全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡(共聚焦超分辨成像系統(tǒng))：日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 COS的酶法制備

探究酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響時(shí)，反應(yīng)體系包含制得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％COS溶液10mL(乙酸鈉緩沖液，pH6.0)和0.3mL酶液，50℃下酶解8h，間隔1h取樣測(cè)定還原糖含量。

探究加酶量對(duì)酶解效果的影響時(shí)，向質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％的COS溶液中分別加入殼聚糖酶60、90、120、150、180U/g。體系在50℃下酶解4h，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定還原糖含量。

1.3.2 DNS法測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度

以氨基葡萄糖為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg氨基葡萄糖，溶解定容至100mL，再分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，以去離子水補(bǔ)至1mL，各加入1niLDNS，沸水浴5min，冷卻定容至5mL，于540nm處測(cè)定吸光度?？瞻捉M為同樣步驟下1mL去離子水。

分別取1mL酶解產(chǎn)物，加入1mLDNS溶液，沸水浴中反應(yīng)5min，迅速冷卻至室溫，在540nm處測(cè)量吸光度。去離子水作為空白對(duì)照。

1.3.3 COS的制備工藝

最適酶解條件下得到的殼寡糖酶解液，經(jīng)100℃水浴15min后10000r/min離心除酶。上清液加入體積分?jǐn)?shù)70％乙醇后4℃過(guò)夜。離心收集的上清液依次經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量3000的膜超濾留取濾過(guò)液，經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量300的膜納濾收取截留液后，濃縮并凍干得到COS樣品。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定COS樣品成分

液相色譜條件：色譜儀WatersaequityUPLC,檢測(cè)器WatersaequityPDA，柱溫45℃，流量0.3mL/min，進(jìn)樣量10μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI+)，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度400℃，掃描范圍m/z20-2000。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞和PATU-8988細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)90％RPMll640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/L鏈霉素的培養(yǎng)基內(nèi)；MDA-MB-231細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，其他條件同上。于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每3d傳一代。

1.3.6 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生存率

取匯合度90％的細(xì)胞，5×10³個(gè)/mL的細(xì)胞濃度鋪板至96孔板?？疾?～1000μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)COS對(duì)3株腫瘤細(xì)胞作用24h的生存率影響。COS與阿霉素(DOX)復(fù)合給藥時(shí)，首先確定DOX質(zhì)量濃度為細(xì)胞生存率為50％所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(IC₅₀)，即2.5μg/mL。以質(zhì)量濃度為1、10、100、1000μg/mL的COS作用6h后給藥DOX孵育24h。之后每孔加10μLCCK-8，孵育1.5h后測(cè)A_450nmo陽(yáng)性對(duì)照組為DOX，空白組為培養(yǎng)基，計(jì)算細(xì)胞生存率，公式如下：

式中：V為細(xì)胞生存率，％；A_P為藥物組在450nm處吸光度；A_B為空白組存450nm處吸光度；A_C為對(duì)照組在450nm處吸光度。

1.3.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

匯合度90％的MDA-MB-231細(xì)胞消化后，以饑餓培養(yǎng)基重懸，以每孔1×10⁵個(gè)接種于24孔板的小室內(nèi)。細(xì)胞完全貼壁后加入500μg/mLCOS培養(yǎng)24h，吸去培養(yǎng)基。多聚甲醛固定30min，DPBS洗3遍，結(jié)晶紫染色30min。用流水沖至孔板無(wú)色，將小室取出，擦凈內(nèi)部底面后倒置拍照。之后將小室放入24孔板中，每孔加1mL體積分?jǐn)?shù)33％冰醋酸，振蕩，取200μL液體測(cè)A_570nm。

1.3.8 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞對(duì)DOX的攝取

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以1×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞濃度鋪板至激光共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿。聯(lián)用組加入500μg/mLCOS1mL，作用4h后再加入1mL含有2倍終質(zhì)量濃度DOX培養(yǎng)基，對(duì)照組為DOX單獨(dú)給藥組。培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1、3、5h。吸去培養(yǎng)基，DPBS洗1遍，經(jīng)多聚甲醛同定和DAPI染色各20min后，DPBS洗3遍。包裹錫箔紙，避光拍照。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素?cái)?shù)據(jù)采用單向方差分析法分析。顯著性差異表示為*4P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。用GraphPadPrism軟件制圖分析。

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