1.3. 4揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測

1) 香氣化合物提取

根據(jù)頂空固相微萃取法(HS-SPME)改進的方法[31]提取揮發(fā)性風(fēng)味化合物，并用GC/MS進行分析。將10mL“美樂”葡萄酒樣品和3.6gNaCl放入15mL萃取瓶中，再加入20uL20mg/L的3-辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。萃取瓶用內(nèi)襯密封，樣品在45℃下平衡20min，微萃取在45℃、500r/min的攪拌下持續(xù)60min。萃取結(jié)束將萃取頭插入進樣口解吸5min。

2) 色譜條件

用Agilent7890B氣相色譜儀與5977A質(zhì)譜儀進行GC-MS分析。色譜柱型號HP-Innowaxcolumn柱(60m×2.5mm×0.25μm)，載氣是流量為1mL/min的氦氣，進樣口溫度230℃。柱溫采用程序升溫：初始溫度50℃保留5min，以3％/min升至125℃保留3min，然后以2℃/min升至180℃保留3min，最后以15℃/min升至230℃保留15min。

質(zhì)譜儀在電子轟擊源(EI)的電離模式下運行，使用問隔為0.2S的全掃捕模式(掃捕范圍m/z40～450)，離子源溫度200℃。

定性和定量分析：通過將各組分峰中的化合物與NISTl4.L譜庫的標(biāo)準(zhǔn)化合物進行匹配，并將得到的質(zhì)譜和保留指數(shù)(RI)與NISTl4.L譜庫巾的標(biāo)準(zhǔn)化合物進行比較。用內(nèi)標(biāo)法計算各組分的相對含量，結(jié)果表示為3個重復(fù)的“美樂”葡萄酒樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果分析

2.1 殼聚糖載體交聯(lián)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)對載體制備的影響

殼聚糖微球載體懸掛醛基的數(shù)量與其固定化酶能力的強弱有關(guān)。不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛對殼聚糖微球載體上懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖2。

由圖可知，在一定范圍內(nèi)，隨著戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，載體上的懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，但是當(dāng)戊二醛溶液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到5％時，載體上懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.4％，之后隨戊二醛體積分?jǐn)?shù)增加，載體上懸掛醛基反而趨于平穩(wěn)。使用不同加酶量，測得數(shù)據(jù)與此一致。結(jié)果說明，體積分?jǐn)?shù)5％的戊二醛溶液已經(jīng)可以提供足夠多數(shù)量的醛基與殼聚糖載體上的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，此時載體對酶的固定量達(dá)到最大。因此載體制備時選用體積分?jǐn)?shù)為5％的戊二醛溶液作交聯(lián)劑即可。

2.1.2 交聯(lián)時間對載體制備的影響

如圖3所示，在2～8h范圍內(nèi)，載體上的懸掛醛基隨交聯(lián)時間的增加而增加；當(dāng)交聯(lián)時問達(dá)到8h后，懸掛醛基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變。說明8h的交聯(lián)時間足以使戊二醛溶液中的醛基與載體上的氨基充分反應(yīng)，使載體對酶的固定量最大。因此，選擇8h作為殼聚糖微球載體和戊二醛溶液的交聯(lián)時間。

2.2 固定化EC降解酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化EC降解酶的最佳反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性如

如圖4所示，通過游離酶和同定化酶在30、36、42、48、54、60、66℃和72℃條件下的酶活結(jié)果可知，它們的最適溫度分別為30℃和42℃。同定化酶在30～42℃酶活性逐漸增高，最適溫度比游離酶略高；在42℃以后降解EC能力逐漸降低，與酶活呈下降趨勢的游離酶變化基本一致；但固定化酶的酶活在42～72℃均高于游離酶。

出現(xiàn)最適溫度轉(zhuǎn)移可能是南于EC降解酶的空問結(jié)構(gòu)受到同定化載體的影響而略有改變，尤其是在42℃以后，固定化EC降解酶的空間結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，催化底物能力比游離酶略高。也有其他研究結(jié)果表明固定化脲酶與游離酶的最適催化溫度有所差異，但二者的催化效果并不存在顯著差異。

穩(wěn)定性結(jié)果顯示，同定化EC降解酶在42℃條件下存放24h后相對酶活仍能達(dá)到60％以上，說明固定化EC降解酶能夠耐受一定范圍的溫度，對環(huán)境的適應(yīng)性較好，在室溫環(huán)境下無需低溫保護，是一種環(huán)境友好型固定化酶。

2.2.2 固定化EC降解酶的最適pH及其穩(wěn)定性

從圖5可以看出，在pH為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5和4.8的條件下，游離酶和固定化酶催化底物EC的最適pH有所偏離，游離EC降解酶對pH4.5的EC溶液具有最大的催化活性，且在pH3.0～4.5酶活性逐漸增加，相對酶活在30％～100％之問；同定化EC降解酶的最適pH為3.6～3.9，且在此范圍內(nèi)酶活性均高于游離酶，尤其在pH3.6左右表現(xiàn)出最大催化活性。

穩(wěn)定性結(jié)果顯示，固定化酶在最適pH條件下反應(yīng)時間越長，相對酶活性的下降速度越快，尤其是12～24h期問的相對酶活變化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0～12h的變化率。同定化酶在pH3.6條件下放置24h之后的酶活損失率不超過40％，說明固定化EC降解酶的耐酸性較游離酶好，更適于復(fù)雜環(huán)境的操作。之前就有研究將以京尼平為交聯(lián)劑與來源于普羅維登斯菌(ProvidenciarettgeriJN-B815)的酸性脲酶進行交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)此交聯(lián)酶能夠適應(yīng)黃酒的復(fù)雜微環(huán)境并去除尿素和EC。
 

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