固定化生物技術(shù)是使水溶性的細(xì)胞/酶與水不溶載體在物理或化學(xué)方法的作用下成為水不溶性細(xì)胞/酶的一類技術(shù)。酶同定化技術(shù)是用同體材料將游離的酶束縛或限制于一定區(qū)域，但仍具有催化活性并可重復(fù)使用的一種技術(shù)，其優(yōu)點是：1)與游離酶相比，酶穩(wěn)定性更高：2)可重復(fù)使用，節(jié)約資源；3)易于從目標(biāo)物巾實現(xiàn)分離；4)酶活性保留時問長：5)環(huán)保，對產(chǎn)物的影響較小。但也存在以下幾點不足：對同定化技術(shù)要求高，增加成本；制備過程酶活受影響：固定化酶的效果受多種因素影響因而存在較大差異。

自1910年酶的固定化研究開始，酶的固定化技術(shù)也得到了很好的發(fā)展，尤其是酶的固定化新型載體層出不窮。人們常根據(jù)不同的應(yīng)用需求選擇不同的同定化載體，不僅要求它的同定化性能好。比如食品領(lǐng)域就要求高安全性能、無污染性、經(jīng)濟實用性等。根據(jù)固定化載體的組成成分可將其基本分為以下3大類：無機載體(硅藻土、活性炭、多孔陶瓷、玻璃等、天然高分子材料(殼聚糖、淀粉、海藻酸鈉、纖維素等和合成有機材料(常見的有聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、氧化石墨烯等。依據(jù)酶與載體的結(jié)合方式可將酶的固定化方法分為4類：吸附法是依靠帶電的酶與載體之問的靜電作用，使酶吸附于載體表面上的一種方法。包埋法是將酶用物理的方法包埋在各種載體(網(wǎng)格或半透膜)內(nèi)，此法是目前應(yīng)用最多的一種理想的固定化方法。交聯(lián)法是借助雙功能試劑使酶分子和載體之間發(fā)生交聯(lián)的一種固定化方法.此法固定的酶具有良好的穩(wěn)定性，常用的雙功能試劑有戊二醛、甲醛、京尼平、雙偶氮苯等。共價偶聯(lián)法是借助共價鍵將載體的功能基團(芳香氨基、羥基、羧甲基等)和酶的活性非必需側(cè)鏈基團(羧基、巰基、羥基、酚羥基和咪唑基等)進行偶聯(lián)的一種方法。

在已有的報道中對固定化酶有如下研究：彭虹旎等以氨基多糖為材料，戊二醛為交聯(lián)劑制備了表面光滑氨基多糖微球載體和多孔氨基多糖微球載體。以此載體對脲酶進行固定化，結(jié)果表明：多孔微球載體的同定化效率和同定化酶活力均高于表面光滑微球載體，因其固定的酶量更多，故表現(xiàn)出更高的酶活力。2015年，王簡之等使用磁性復(fù)合微球?qū)χ久高M行固定化，得到的固定化脂肪酶在熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性、重復(fù)使用率方面有所提升。在pH4.0，共價固定6h后，固定化脂肪酶的酶活損失低于40％。有研究者將甲基丙烯、問苯二胺水凝膠、殼聚糖和氧化石墨烯反應(yīng)制備復(fù)合材料，制得的復(fù)合凝膠在機械強度和吸附能力方面都有所提升。

凝膠在機械強度和吸附能力方面都有所提升。同定化酶在提高食品利用率和營養(yǎng)價值方面有突出貢獻，比如固定化淀粉酶可以將淀粉分解為易被人體吸收的短鏈小分子糖：固定化脂肪酶可用于代可可脂的脫脂；而研究較多的固定化脲酶已應(yīng)用于酒精飲料中尿素和EC的去除，可以提升發(fā)酵飲品的飲用安全性。為了充分發(fā)揮脲酶的實用價值，國內(nèi)外研究者已對脲酶的同定化進行了不少探索，而直到近幾年，國內(nèi)學(xué)者才逐漸展開對EC降解酶的固定化研究。趙雅敏對篩選到的產(chǎn)EC降解酶的菌株LBMAE-8進行研究，發(fā)現(xiàn)對該菌進行細(xì)胞固定化處理，殼聚糖/海藻酸鈣微膠囊一步法比海藻酸鈣包埋法制得的固定化細(xì)胞的酶活回收率高。張遷等將來自P.rettgeriJN-B815的酸性脲酶經(jīng)乙醇沉淀、離子交換等純化后用殼聚糖微球進行固定化，制備的固定化酸性脲酶的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及對黃酒中尿素和EC的去除率均有所提升俐。劉小鋒使用氧化石墨烯(GO)和殼聚糖(CS)復(fù)合微球?qū)λ嵝噪迕高M行固定化，在流化床反應(yīng)器中考察同定化酸性脲酶對黃酒的處理效果，該酶對黃酒中尿素的去除率高達93.85％，而對EC的去除率達到57.46％。

固定化酶的酶活力、底物親和力、米氏常數(shù)、反應(yīng)活化能等性質(zhì)會由于酶的性質(zhì)、載體材料的性質(zhì)及包埋條件的不同而發(fā)生改變，因此，一般對載體材料和同定化方法經(jīng)過實驗摸索才能確定最佳方案。通過篩選產(chǎn)EC降解酶的微生物并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，從而獲得一定數(shù)量的EC降解酶并將其應(yīng)用于國內(nèi)酒精飲料中EC含量的降低成為目前研究的一個熱點。

作者同繞固定化EC降解酶的固定條件、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用展開研究，為保障發(fā)酵飲品的安全性提供理論支持。

1 材料與方式

1.1 材料與試劑

選取經(jīng)活化和優(yōu)化培養(yǎng)的CAT-4(Kluyvero-mycesmarxianus)酵母菌株作為出發(fā)菌株，取其發(fā)酵液通過反復(fù)凍融結(jié)合超聲破碎法得到EC降解酶粗酶液，待用。乙醇(色譜純)：天津致遠(yuǎn)公司產(chǎn)品；氨基甲酸乙酯、正丙基甲酸酯：Sigma-aldrich公司產(chǎn)品：其余溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DVB/CAR/PDMS(50/30pom)SPME萃取頭、7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品：FRESCO21高速冷凍離心機：ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品：AS-4S超聲細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；722型可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 微球載體的制備及交聯(lián)條件的優(yōu)化

1) 滴入法制備殼聚糖微球

稱取0.5g殼聚糖溶解于50mL體積分?jǐn)?shù)1.0％的醋酸溶液中，置于搖床上活化2h，將活化的殼聚糖用注射器逐滴加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)20％NaOH和體積分?jǐn)?shù)30％CH3OH的凝結(jié)液中，挑選出粒度均勻、形狀規(guī)整的殼聚糖微球，用去離子水洗至中性，冷藏備用。

2) 戊二醛交聯(lián)殼聚糖載體的制備

將上述制備的微球置于體積分?jǐn)?shù)6％戊二醛溶液巾，在30℃恒溫水浴鍋巾振蕩6h。反應(yīng)完成后，用去離子水反復(fù)洗滌，以去除剩余的戊二醛，直至洗滌液在280nm處的吸光度小于0.01，即得戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球載體。

3) 粗酶液的制備及EC降解酶的固定化

取一定量戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球載體，加入適量CAT-4菌株產(chǎn)生的粗酶液，置于30℃恒溫水浴搖床上振蕩1h。分離棄去上層溶液，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀物，得到后續(xù)實驗所用的同定化EC降解酶。

4) 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對載體制備的影響

配制體積分?jǐn)?shù)2％、3％、4％、5％、6％和7％的戊二醛溶液，用注射器將冷藏的殼聚糖微球緩慢滴加至不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液巾，使其形成直徑均勻的微球，在30℃恒溫水浴鍋中振蕩6h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)洗滌，直至洗滌液在280nm處的吸光度小于0.01，即得戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球載體，置于4℃冰箱保存。用羥胺法[27]測其懸掛醛基質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

5) 戊二醛交聯(lián)時間對載體制備的影響

用注射器將冷藏的殼聚糖微球緩慢滴加至體積分?jǐn)?shù)為6％的戊二醛溶液中，使其形成形狀規(guī)整、均勻的微球，在30oC恒溫水浴鍋中振蕩2、4、6、8、10h。其余操作同1.3.1中4)。

1.3.2 酶活力的測定

分別將1mL粗酶液或1g固定化EC降解酶和超純水加到2支裝有1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％EC溶液的10mL比色管巾，將比色管置于37℃水浴鍋中反應(yīng)15min后加入1mL終止劑，充分混勻后依次加入各1mL的顯色劑I和顯色劑Ⅱ,強烈振蕩后繼續(xù)置于37。C水浴條件下保溫20min，用超純水定容至刻度線，測定并記錄A_625nm值。酶活計算公式如下：

式中：M為酶活力；△A_625nm為反應(yīng)結(jié)束后空白對照與樣品測定的光密度值之差：n為待測樣液的稀釋倍數(shù)：k為NH₄⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線中斜率的倒數(shù)。

1.3.3 EC去除率的測定

1) 相圖的制作

參考文獻使用濁度滴定法測定雙水相體系的二元曲線。具體做法如下：將乙醇逐滴加入盛有已知濃度K₂HPO。溶液的玻璃容器中，直到在25℃時形成界限清晰的兩相體系。記錄此時乙醇和K₂HPO₄組成。在此基礎(chǔ)上，將去離子水滴加到玻璃容器中，得到一個清晰的單相體系，繼續(xù)滴加乙醇，再形成兩相體系，如此反復(fù)。接著用不同質(zhì)量濃度的K₂HPO₄重復(fù)上述步驟，記錄數(shù)據(jù)。

2) 乙醇和K₂HPO₄雙水相體系(ATPS)

提取“美樂”葡萄酒中EC圖1顯示了用乙醇和K₂HPO₄雙水相體系提取EC的原理。以含50μg/LEC和100μg/L正丙基甲酸酯(PC)的體積分?jǐn)?shù)55％乙醇溶液作為模型溶液，用酒石酸和NaOH調(diào)節(jié)pH并記錄當(dāng)前的pH。

量取5mL模型溶液和過量的K₂HPO₄固體加人離心管中，混勻后以4000r/min離心5min，以確保兩相完全分離。將離心管置于25℃恒溫水浴中持續(xù)3.5h達到相平衡。記錄頂相體積并取1.5mL的頂部溶液與150mg無水硫酸鎂完全混合，在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下離心1min。最后，將1mL上清液通過0.45μm膜過濾，用于GC-MS分析。

3) EC的GC-MS檢測

使用Agilent7890BGC-5977AMS系統(tǒng)進行EC的定量和定性分析。氣相色譜柱為Carbowax20M(30m×0.25μm×0.25mm)，以氦氣為載氣，流量為1.0mL/min，進樣口溫度200℃，檢測器溫度250℃。柱溫采用程序升溫：初始溫度50℃保留1min，以3℃/min升至180℃保留1min，然后以20℃/min升至220℃，保留10min。

質(zhì)譜條件：以氦氣為載氣.采用電子轟擊源(EI)的電離模式，電子能量70eV；四級桿溫度150℃；離子源溫度230℃；選取離子監(jiān)測(SIM)模式，選擇質(zhì)荷比(m/z)分別為62、74和89作EC的監(jiān)測離子，m/z為62作定量離子：選擇m/z分別為59、62和89來監(jiān)測PC，m/z為62作定量離子。

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相關(guān)鏈接：氨基甲酸乙酯，甲酸酯，硫酸鎂，殼聚糖