多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法是目前測定地表水中糞大腸菌群的常用標(biāo)準(zhǔn)方法,通過三種方法對糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實際地表水樣進(jìn)行分析檢測,結(jié)果表明:多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法用于糞大腸菌群的檢測結(jié)果具有一致性;通過三種方法優(yōu)缺點的對比,多管法成本低適用于常規(guī)檢測,紙片法高效方便更適用于大批量快速檢測,酶底物法操作簡單,不受場地限制可直接現(xiàn)場檢測,更適用于應(yīng)急現(xiàn)場監(jiān)測。

前言

糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群，是在44.5℃能生長并發(fā)酵乳酸產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。環(huán)境地表水中的糞大腸菌群主要來自糞便的污染，因此通過測定水中糞大腸菌群的含量，可間接得出水體受糞便污染的情況，是當(dāng)前國內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測部門主要監(jiān)測項目之一，是評價水體污染程度和環(huán)境衛(wèi)生的重要指標(biāo)，在《地表水環(huán)境質(zhì)量（GB3838—2002）》中，規(guī)定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ類水糞大腸菌群的含量依次≤200、200～2000、2000～10000、10000～20000及20000～40000個/L，我國地表水體糞大腸菌群含量普遍較高，部分水域含量甚至超過Ⅴ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法是目前國內(nèi)測定地表水中糞大腸菌群常用的標(biāo)準(zhǔn)方法。多管發(fā)酵法早在1985年就列入《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法（GB5750-85）》，并于2018年發(fā)布修訂版，是糞大腸菌群測定的經(jīng)典方法，它作為《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》中的推薦方法，美國公共衛(wèi)生協(xié)會（APHA）出版的《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法（20版）》中方法9221E也采用的是多管發(fā)酵法；紙片法在西方發(fā)達(dá)國家運用較少，主要在一些發(fā)展中國家使用，環(huán)保部在2015年發(fā)布了紙片法的標(biāo)準(zhǔn)方法，它作為《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》中的推薦方法（C類方法）；酶底物法是一種新型酶技術(shù)檢測方法，已在美、日、韓和歐洲許多國家使用,2003年從美國引入我國，環(huán)保部在2018年發(fā)布了酶底物法的標(biāo)準(zhǔn)方法。三種方法均是糞大腸菌群檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，但在檢出限、檢測時間和操作過程等存在差異，本文參照環(huán)保行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，分別從糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實際地表水樣進(jìn)行檢測分析和對比研究，并從監(jiān)測時間、成本、環(huán)境等總結(jié)出各方法的優(yōu)缺點和適用范圍，為廣大環(huán)境監(jiān)測分析人員根據(jù)實際條件和水樣類型選擇最佳方法分析測試提供借鑒與參考。

1實驗部分

1.1試劑和材料

乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，EC肉湯培養(yǎng)基，糞大腸紙片I、II型，糞大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，DST(deflned)MMO-MUG酶底物試劑，無菌水，陽性菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922，陰性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048。

1.2儀器和設(shè)備

采樣瓶，隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9160，恒溫培養(yǎng)箱：HH.B11.420-135-Ⅱ，高壓蒸汽滅菌器：YXQ-LS-100G，程控定量封口機：2009D,97孔定量盤，標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤，接種環(huán)，1mL移液管，試管：15mm×150mm。

1.3實驗方法

多管發(fā)酵法HJ347.2—2018；紙片法HJ755—2015；酶底物法HJ1001—2018。

2實驗結(jié)果與討論

2.1空白對照

空白對照用無菌水做全程序空白測定。(1)多管發(fā)酵法：初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵的管中均無顏色變化，滿足標(biāo)準(zhǔn)空白要求；(2)紙片法：培養(yǎng)后的紙片上無任何微生物生長，滿足標(biāo)準(zhǔn)空白要求；(3)酶底物法：培養(yǎng)后的97孔定量盤中無顏色反應(yīng)，滿足H標(biāo)準(zhǔn)空白要求。

2.2陽性及陰性對照

按多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法三種方法實驗要求進(jìn)行培養(yǎng)，陽性菌株呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

2.3糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果（見表1)

由表1可知，三種方法對糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的六次測試結(jié)果均在可接受范圍（83～312067MPN/L）內(nèi)；從標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來看，多管發(fā)酵法為3.37%，紙片法為2.44%，酶底物法為1.87%，均滿足各自對應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求；從相對誤差來看，多管發(fā)酵法為3.72%，紙片法為2.6%，酶底物法為3.34%，均滿足各自對應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)中相對誤差的要求。

2.4實際地表水樣結(jié)果（見表2)

18個不同環(huán)境地表水樣同時用多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法在相同條件下進(jìn)行檢測，為了使數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行取對數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，運用SPSS兩兩進(jìn)行雙樣本配對t檢驗。

由表2數(shù)據(jù)可以看出，相關(guān)系數(shù)r分別為0.983、0.990、0.993，說明三組數(shù)據(jù)相關(guān)性較好；各組的t值分別為0.056、0.124、0.247，均小于t0.05(17)=2.110，說明三種方法對同一樣品的分析結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異，即多管法、紙片法和酶底物法的實驗結(jié)果具有一致性。

2.5三種方法的優(yōu)缺點對比（見表3)

由表3可知，從實驗操作來看，多管發(fā)酵法需要配置培養(yǎng)基并滅菌，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，分析時間是48h左右、監(jiān)測時間長、操作過程煩瑣且在滅菌環(huán)境下檢測；紙片法和酶底物法均可即時接種開始實驗，較為簡便，酶底物法接種的工作量明顯比多管和紙片法少很多，效率最高，紙片法相比多管法而言無須進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，效率比多管法高。從儀器設(shè)備來看，紙片法只需要隔水培養(yǎng)箱，多管法和酶底物法除了隔水培養(yǎng)箱外，均還需要一個設(shè)備。從經(jīng)濟成本來看，單個樣品的成本多管發(fā)酵法最低，其次為紙片法，酶底物法成本最高。

3結(jié)語

通過多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法對標(biāo)準(zhǔn)樣品和實際地表水樣的實驗對比研究可知，同一樣品三種方法對糞大腸菌群檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異，其結(jié)果具有一致性。它們作為環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)方法，各有優(yōu)缺點，可根據(jù)不同的條件和要求選擇合適的方法。多管發(fā)酵法和紙片快速法已經(jīng)列為《國家地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測任務(wù)作業(yè)指導(dǎo)書（試行）》的指定方法。

綜上所述，多管發(fā)酵法應(yīng)用最為廣泛，適用于水樣稀釋倍數(shù)未知的情況和環(huán)境監(jiān)測部門的常規(guī)檢測；紙片法更適用于大批量樣品的快速檢測；酶底物法雖成本昂貴，但操作簡單，對檢測環(huán)境沒有特殊要求，更適用于環(huán)境事故應(yīng)急監(jiān)測。

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