2.3.4 3種檢測方法的一致性分析

對于24例慢性HBV感染患者血清樣本，3種試劑C、D和E的HBV DNA定量結(jié)果的一致性分析見圖4～6。試劑C與D檢測結(jié)果的差值平均值為0.28 log10 IU/mL,差值標(biāo)準(zhǔn)差為0.30 log10 IU/mL,95%一致性界限為0.28±1.96×0.30(-0.30,0.86),95.83%(23/24)的點在95%一致性界限以內(nèi)，其一致性界限范圍內(nèi)試劑C和D測定值的最大差異為0.85 log10 IU/mL(圖4)。試劑C與E檢測結(jié)果的差值平均值為0.80 log10 IU/mL,差值標(biāo)準(zhǔn)差為0.72 log10 IU/mL,95%一致性界限為0.80±1.96×0.72(-0.62,2.21),95.83%(23/24)的點在95%一致性界限以內(nèi)，其一致性界限范圍內(nèi)試劑C和E測定值的最大差異為1.96 log10 IU/mL(圖5)。試劑D與E檢測結(jié)果的差值平均值為0.51 log10 IU/mL,差值標(biāo)準(zhǔn)差為0.64 log10 IU/mL,95%一致性界限為0.51±1.96×0.64(-0.74,1.77),91.67%(22/24)的點在95%一致性界限以內(nèi)，其一致性界限范圍內(nèi)試劑D和E測定值的最大差異為1.25 log10 IU/mL(圖6)。3種試劑檢測24例臨床血清樣本的差值分布特點見表4。

2.3.5 19例超出定量線性范圍的臨床血清樣本檢測結(jié)果比較

對于檢測結(jié)果低于至少一種試劑定量下限的11例樣本(表5):2例樣本，3種試劑均未檢出；2例樣本，試劑C和D均檢出，但均低于其定量線性下限，而試劑E未檢出；7例樣本，試劑C和D的檢測結(jié)果均在其定量線性范圍內(nèi)，經(jīng)Wilcoxon符號秩和檢驗，試劑C與D的檢測結(jié)果間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.498),而試劑E有2例未檢出，另外5例雖檢出，但均低于其定量線性下限。對于檢測結(jié)果高于至少一種試劑定量上限的8例樣本(表5):1例樣本，檢測結(jié)果均高于3種試劑相應(yīng)定量上限；1例樣本，高于試劑C和D的線性上限，試劑E檢測的結(jié)果為8.42 log10 IU/mL;2例樣本，試劑C的檢測結(jié)果高于其線性上限，試劑D的檢測結(jié)果在其定量線性范圍內(nèi)，分別為7.38、7.91 log10 IU/mL,試劑E的檢測結(jié)果在其定量線性范圍內(nèi)，分別為7.17、7.68 log10 IU/mL;4例樣本，試劑C和D的檢測結(jié)果均高于其線性上限，試劑E檢測的結(jié)果分別為7.57、6.75、7.32、6.96 log10 IU/mL。

2.3.6試劑C和D檢測臨床血清樣本的相關(guān)性分析

對于43例慢性HBV感染患者血清樣本，其中有31例血清樣本的檢測結(jié)果均在試劑C和D的定量范圍內(nèi)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)r=0.966(P<0.001),回歸方程Y=0.903X+0.036。將試劑C檢測這31例血清樣本所得的結(jié)果以2000 IU/mL為截斷，分為兩組：≥2000 IU/mL組有18個標(biāo)本，試劑C與D檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.950(P<0.001),回歸方程Y=0.986X-0.235;<2000 IU/mL組有13個標(biāo)本，試劑C與D檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.710(P=0.007),回歸方程Y=0.672X+0.757,提示低病毒血癥時2種試劑的檢測結(jié)果相關(guān)性較差。

3討論

HBV DNA是乙型肝炎診治中最重要的分子標(biāo)志物，可用于確定治療指征和監(jiān)測治療等，例如指南建議盡早識別病毒學(xué)突破、調(diào)整抗病毒治療，而病毒學(xué)突破(viral breakthrough)是指患者血清HBV DNA水平與最低值相比上升超過1 log10 IU/mL(10倍)。慢性HBV感染者的精準(zhǔn)管理高度依賴于HBV DNA的準(zhǔn)確定量，而影響HBV DNA定量準(zhǔn)確性的因素很多，包括核酸提取所用樣本量、核酸提取方法、樣品中酶抑制劑、熒光定量PCR儀、PCR反應(yīng)體系中模板濃度、PCR引物和熒光探針等。HBV DNA在不同的實驗室可能應(yīng)用不同的試劑檢測，試劑的差異可能改變病毒載量結(jié)果，導(dǎo)致HBV DNA定量結(jié)果偏高或偏低，特別是在醫(yī)學(xué)決定水平，因而可能影響臨床決策。另外實驗室在更換檢測試劑時，臨床一致性是最重要的指標(biāo)，通過它來判斷結(jié)果的等效性。因此用于患者診斷或治療管理的決策不僅基于患者的狀態(tài)，而且可能還依賴于當(dāng)時所使用的檢測方法和試劑。

目前我國市面上有多種國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)的基于熒光定量PCR技術(shù)的HBV DNA定量檢測商品化試劑盒。本研究選擇了2種進(jìn)口試劑和3種國產(chǎn)試劑(表1),2種進(jìn)口試劑A和B是目前國際通用的HBV DNA定量試劑，但由于價格高昂、檢測成本高而在我國應(yīng)用有限，更多的實驗室用的還是國產(chǎn)試劑。因此選擇了3種國產(chǎn)試劑C、D和E,為目前國內(nèi)市場占有率較高的3種試劑，均采用各自配套的半自動化磁珠式核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。由于不同型號的熒光定量PCR儀可能影響檢測結(jié)果,將3種試劑均在COBAS®Z480全自動熒光定量PCR分析儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

本研究主要探討應(yīng)用不同的試劑檢測臨床血清標(biāo)本HBV DNA的結(jié)果一致性，以評價不同試劑的臨床性能以及在日常臨床實踐中互換使用的可接受性。本研究分為兩部分，第一部分探討不同試劑的差異是否影響HBV DNA檢測結(jié)果，首先應(yīng)用小樣本量的臨床混合血清樣本對此進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)兩種進(jìn)口試劑A和B的檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而C、D和E 3種國產(chǎn)試劑僅有C與試劑A的檢測結(jié)果間無統(tǒng)計學(xué)差異，試劑D、E的檢測結(jié)果均顯著低于試劑A(P<0.05),提示這3種國產(chǎn)試劑的檢測性能可能與國際公認(rèn)的進(jìn)口試劑之間存在差異；進(jìn)一步驗證3種國產(chǎn)試劑的檢測性能，發(fā)現(xiàn)2個水平國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的實際檢測值與其靶值的差值均小于±0.4 log10 IU/mL,符合我國NCCL室間質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA定量檢測的可接受范圍≤±0.4 log10 IU/ml;3種國產(chǎn)試劑C、D、E的CV均小于5%,符合國際上常用的可接受定量標(biāo)準(zhǔn)CV≤5%,因此3種試劑的檢測性能(正確度和精密度)均滿足臨床應(yīng)用要求。

本研究第二部分?jǐn)U大樣本量探討3種國產(chǎn)試劑在檢測臨床血清樣本的定量結(jié)果一致性以及臨床性能是否存在差異，發(fā)現(xiàn)試劑E的檢出率略低于試劑C和D,可能存在漏檢；3種國產(chǎn)試劑檢測24例臨床血清樣本(3種試劑的檢測結(jié)果均在其定量范圍內(nèi))的結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且分析發(fā)現(xiàn)：試劑C與D的相關(guān)性和一致性較好、D與E次之、C與E最差；進(jìn)一步分析試劑C和D檢測31例臨床血清樣本(2種試劑的檢測結(jié)果均在其定量范圍內(nèi))的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種試劑檢測低病毒載量的相關(guān)性與高病毒載量時相比差。這些均提示3種HBV DNA定量試劑的臨床性能差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究中3種國產(chǎn)試劑的正確度和精密度均符合國家要求，但對臨床血清樣本的結(jié)果卻存在顯著差異，其原因可能包括：①核酸提取效率可能存在差異：雖然3種國產(chǎn)試劑都是采用敏感的磁珠法提取核酸，但血清上樣量不同，例如試劑E的血清上樣體積是C的3倍而洗脫體積、加入PCR體系的模板體積均相同(表1),理論上E的PCR反應(yīng)體系中DNA濃度應(yīng)高于C,但E的檢出率卻低于C,提示核酸提取效率可能存在差異；②PCR擴(kuò)增效率可能存在差異：由于臨床血清樣本中存在PCR抑制劑如血紅蛋白、肝素等，3種試劑的抗干擾能力可能不一致，從而導(dǎo)致其擴(kuò)增效率可能存在差異；③檢測不同基因型和突變病毒株的能力可能存在差異：3種試劑聲稱的檢測亞型稍有差異，但究其各自能力如何未驗證；3種試劑的引物和探針序列可能并不相同，HBV是一種高度變異的DNA病毒，抗病毒治療中HBV DNA序列可能發(fā)生耐藥性突變，若突變位于引物或探針結(jié)合區(qū)域，則可導(dǎo)致樣本的病毒載量被低估；Liu等建議準(zhǔn)確定量HBV DNA可能需要兩個靶標(biāo)，例如基于S和C區(qū)域的雙重實時PCR檢測。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)3種常用國產(chǎn)試劑定量檢測臨床血清樣本HBV DNA的性能存在顯著差異，在常規(guī)臨床實踐中互換用于臨床決策時務(wù)必慎重。但由于本研究評估臨床性能時所用血清樣本量較小，是否影響臨床決策有待進(jìn)一步研究。

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