克霉唑?yàn)檫溥蝾?lèi)廣譜抗真芮藥，是治療真蔭感染疾病的合成抗菌藥，對(duì)多種真菌尤其是白色念珠菌具有較好的抗菌作用?？嗣惯?qū)儆诘诙溥蝾?lèi)的抗真菌藥，1981年和咪康嘩、酮康嘩、益康嘩等抗真菌藥在美國(guó)上市。美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)目前只批準(zhǔn)了嘩類(lèi)、嘧啶類(lèi)和多烯類(lèi)等抗真菌藥用于人體的全身性真菌治療。目前已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗真菌藥具有細(xì)胞毒性較強(qiáng)的問(wèn)題。因此有必要加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源食品中克霉唑殘留量的檢測(cè)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)克霉唑的測(cè)定主要集中在藥品方面，采用的方法多為高效液相色譜法。關(guān)于環(huán)境和食品克霉唑測(cè)定研究較少，Assress等采用了UHPLC-QTOF-MS對(duì)污水中克霉唑在內(nèi)的嘩類(lèi)殺菌劑進(jìn)行目標(biāo)定量及其他新興污染物的篩選，張凱等采用UPLC-MS/MS法測(cè)定了羊肉中克霉嘩在內(nèi)的8種抗真菌藥含黃。加速溶劑提取(ASE)具有提取效率高、所用溶劑少、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)將色譜高效的分離效能和質(zhì)潛的高靈敏度、強(qiáng)抗十?dāng)_的臨測(cè)能力相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在復(fù)雜基質(zhì)背景下對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確測(cè)定。有關(guān)動(dòng)物源食品中克霉唑殘留的GC-MS/MS測(cè)定國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以環(huán)己烷/乙酸乙酯為提取溶劑，加速溶劑提取動(dòng)物源食品中殘留的克霉唑，提取液經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后進(jìn)行GC-MS/MS分析，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，該方法能夠滿足動(dòng)物源食品中克霉唑殘留最的確證和定苗分析。

1材料與方法

1.1材料與儀器

豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎樣品市售；克霉嘩標(biāo)準(zhǔn)品(CASN0.23593-75-1，99.9％純度)德國(guó)Dr.EhrenstorferCml)H；克霉唑-d5(99.0％純度)加拿大CDN公司；色譜純乙腈、正己烷和乙酸乙酯德國(guó)Merck公司。
Milli-QAdvantageA10超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；STl6R離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；GM300組織搗碎機(jī)：德國(guó)萊馳公司；MS105DU電子天平、PL203電子天平：梅特勒公司；T18型均質(zhì)器德國(guó)IKA公司；DionexASE350加速溶劑提取儀：美國(guó)Dionex公司；GPCVario凝膠滲透色潛儀：德國(guó)LC-Tech公司；ThermoFisherTrace1300-TSQ8000三重四極桿氣相色潛-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Therrno公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取克霉嘩-d₅標(biāo)準(zhǔn)品1mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉嘩-d₅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用乙腈稀釋配制濃度分別為1、2、5、20、50、100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其巾克霉嘩-d₅同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為20μg/L。

1.2.2試樣制備

取有代表性豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎樣品樣品各500g，將其切碎后，用組織搗碎機(jī)將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。

1.2.3加速溶劑(ASE)提取

稱(chēng)取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進(jìn)行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對(duì)提取池體積30％的提取溶劑進(jìn)行氮?dú)獯祾?0s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補(bǔ)加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。

1.2.4凝膠滲透色譜(GPC)凈化

凝膠滲透色譜(GPC)條件如下：凈化柱：500mm×10mm，填裝10gBioBeads-X3填料，柱床高32cm；流動(dòng)相：體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯，流速為1.0mL/min；樣品定量環(huán)為1mL；預(yù)淋洗體積為17mL；洗脫體積為15mL；清洗體積為5mL。稱(chēng)取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進(jìn)行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對(duì)提取池體積30％的提取溶劑進(jìn)行氮?dú)獯祾?0s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補(bǔ)加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。制備的待凈化液1mL通過(guò)凝膠滲透儀按上述條件凈化，收集洗脫液于刻度離心管中。

1.2.5液液分配

將收集到的洗脫液于45℃的水浴中氮?dú)獯抵两?，?.5mL乙腈飽和的正己烷渦旋振蕩溶解殘余物，再加入0.5mL正己烷飽和的乙腈，渦旋振蕩并靜置分層，吸出乙腈層于2mL進(jìn)樣小瓶中，向刻度離心管中重復(fù)加入0.5mL正己烷飽和的乙腈重復(fù)操作一次，合并乙腈層，過(guò)0.22μm濾膜于GC-MS/MS的進(jìn)樣小瓶中，制得待測(cè)樣品溶液，供GC-MS/MS測(cè)定。

1.2.6基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取有代表性豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎樣品樣品各500g，將其切碎后，用組織搗碎機(jī)將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。稱(chēng)取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進(jìn)行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對(duì)提取池體積30％的提取溶劑進(jìn)行氮?dú)獯祾?0s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補(bǔ)加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。凝膠滲透色譜(GPC)條件如下：凈化柱：500mm×10mm，填裝10gBioBeads-X3填料，柱床高32cm；流動(dòng)相：體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯，流速為1.0mL/min；樣品定量環(huán)為1mL；預(yù)淋洗體積為17mL；洗脫體積為15mL；清洗體積為5mL。稱(chēng)取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進(jìn)行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對(duì)提取池體積30％的提取溶劑進(jìn)行氮?dú)獯祾?0s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補(bǔ)加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。制備的待凈化液1mL通過(guò)凝膠滲透儀按上述條件凈化，收集洗脫液于刻度離心管中。將收集到的洗脫液于45℃的水浴中氮?dú)獯抵两?，?.5mL乙腈飽和的正己烷渦旋振蕩溶解殘余物，再加入0.5mL正己烷飽和的乙腈，渦旋振蕩并靜置分層，吸出乙腈層于2mL進(jìn)樣小瓶中，向刻度離心管中重復(fù)加入0.5mL正己烷飽和的乙腈重復(fù)操作一次，合并乙腈層，過(guò)0.22μm濾膜于GC-MS/MS的進(jìn)樣小瓶中，制得待測(cè)樣品溶液，供GC-MS/MS測(cè)定。制備不含待測(cè)組分的空白基質(zhì)溶液五份各1mL，氮?dú)獯蹈?，再各取克霉唑?biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取克霉嘩-d5標(biāo)準(zhǔn)品1mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉嘩-d₅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用乙腈稀釋配制濃度分別為1、2、5、20、50、100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其巾克霉嘩-d₅同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為20μg/L。配制好的1、2、5、20、50、100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1mL復(fù)溶，配得1、2、5、20、50、100μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中克霉唑-d₅同位素內(nèi)標(biāo)的濃度均為20μg/L。

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