1.2.7色譜條件

HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升溫：初溫60℃，保持1min，以30℃/min升至200℃，冉以15℃/mjn升至300℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度240℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL，載氣為氦氣(純度≥99.999％)，流速1.0mL/min。

1.2.8質(zhì)潛條件

電子電離源(EI)，電離能量70eV，離子源溫度280℃，傳輸線溫度300℃，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，具體條件見表1。
 

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Tracefinder3.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在EI電離源下，采用SCAN模式，對5.0mg/L的克霉嘩及克霉唑-d₅分別進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描分析，選擇豐度最高的作為母離子。在不同碰撞能量下，對目標(biāo)物的母離子分別進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到每個母離子的碎片離子，選擇豐度較高的3個子離子，配制不同種類的空白樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在MRM模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜條件，剔除易受雜質(zhì)干擾，選擇半度最高的2個子離子作為定量離子和定性離子，最后再對每對離子對的碰撞能做優(yōu)化以達(dá)到最佳靈敏度。標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖見圖1。

2.2前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取

實驗中發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)的高速均質(zhì)提取豬肥肉(豬脂肪)和豬肉(同時含豬肥肉和精肉)時，由于樣品粘在均質(zhì)刀頭上，無法充分和提取溶劑接觸，導(dǎo)致克霉嘩的提取效率不高。本實驗首先將樣品在碾缽中與硅藻土充分混勻研磨，硅藻土顆粒不僅能吸收樣品中的水分，且能和樣品的肌肉或脂肪組織充分接觸，使后續(xù)ASE提取時有機(jī)溶劑能充分滲透到樣品中，大大提高了克霉唑的提取效率?？紤]到與后續(xù)GPC凈化流動相的匹配，本實驗選擇了乙酸乙酯/環(huán)己烷(體積比1:1)為提取溶劑。

2.2.2凈化

動物源食品或多或少含有一定量的脂肪，去除脂肪是前處理必須解決的問題。凝膠滲透色譜是去除脂肪的有力工具，但是實驗中發(fā)現(xiàn)通過GPC無法完全去除脂肪，否則會造成部分克霉唑損失回收率偏低，故在GPC之后還需要通過分配步驟使殘余脂肪和克霉嘩分離。GPC洗脫液氮氣吹干后在離心管底有脂肪析出，還需將收集到的洗脫液于45℃的水浴中氮氣吹至近干，取0.5mL乙腈飽和的正己烷渦旋振蕩溶解殘余物，再加入0.5mL正己烷飽和的乙腈，渦旋振蕩并靜置分層，吸出乙腈層于2mL進(jìn)樣小瓶中，向刻度離心管中重復(fù)加入0.5mL正己烷飽和的乙腈重復(fù)操作一次，合并乙腈層，過0.22μm濾膜于GC-MS/MS的進(jìn)樣小瓶中，制得待測樣品溶液，供GC-MS/MS測定的步驟通過液液分配使脂肪和克霉唑分離，使用0.5mL正己烷(乙腈飽和)溶解殘渣，再用0.5mL乙腈(正己烷飽和)反提取克霉嘩，試驗中共用0.5mL乙腈(正己烷飽和)重復(fù)提取3次，考察每次乙腈層中克霉唑的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用2次提取即能達(dá)到90％的回收率，故采用0.5mL乙腈(正己烷飽和)提取2次，合并乙腈層供GCS-MS/MS測定。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1線性關(guān)系與定量限

采用內(nèi)標(biāo)法對克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液；取克霉嘩-d₅標(biāo)準(zhǔn)品1mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉嘩-d₅標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用乙腈稀釋配制濃度分別為1、2、5、20、50、100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其巾克霉嘩-d₅同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為20μg/L。制備的1、2、5、20、50、100μg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)測定，以克霉嘩與克霉嘩-d₅的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，克霉嘩的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在1、2、5、20、50、100μg/L濃度范圍內(nèi)，克霉唑線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.0189426+0.0474255X，決定系數(shù)(R²)為0.9995。定量限(LOQ)采用在空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度的方法來確定，得到克霉唑的定量限(LOQ，S/N≥10)為2.0μg/kg。

2.3.2回收率與精密度

在不同動物源食品的空白樣品中，分別進(jìn)行2.0、5.0、20.0μg/kg三個不同濃度水平的加標(biāo)回收實驗，每個水平重復(fù)測定6次，通過同位素內(nèi)標(biāo)法計算其回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。采用了同位素內(nèi)標(biāo)定量技術(shù)，校正了目標(biāo)物的損失、提高了測量結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，測得克霉唑的回收率在82.6％～116.5％之問，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2％～13.5％，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。代表性的樣品加標(biāo)色譜圖見圖2，在克霉唑出峰處沒有雜質(zhì)干擾，說明本研究采用的凈化步驟取得了良好的效果。

2.4實際樣品檢測

在農(nóng)貿(mào)市場和超市購買不同的動物源食品，豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎，每種樣品各3份，采用本方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，所有的樣品中均未檢出克霉唑藥物殘留。

3結(jié)論

本文建立了動物源食品巾克霉嘩殘留量的同位素稀釋氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)加速溶劑提取后，用凝膠滲透色譜凈化結(jié)合正己烷去除樣品中的脂肪，同位素內(nèi)標(biāo)定景，校正了目標(biāo)物的損失、提高了測量結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，保證了方法有較好的回收率和精密度。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，定量限為2.0μg/kg，同收率在82.6％～116.5％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2％～13.5％，能夠滿足動物源食品中克霉唑殘留量的確證和定量分析，為保障食品安全提供技術(shù)支持。

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