2 液相色譜

高效液相色譜(HPLC)具有高效、快速、靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是化合物純度鑒定和生物大分子分析的通用分析方法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)在保留色譜技術(shù)高效分離優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，通過(guò)MS獲得待測(cè)組分豐富的結(jié)構(gòu)信息，在藥物代謝、復(fù)雜基質(zhì)單一成分鑒定、代謝組學(xué)研究等方面凸顯優(yōu)勢(shì)。

2.1 新型冠狀病毒候選藥物評(píng)估

Zhang等報(bào)告了冠狀病毒藥物靶標(biāo)Mpro與α-酮酰胺抑制劑復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)，通過(guò)LC-MS/MS分析確定α-酮酰胺抑制劑13a和13b具有明顯的肺向性。Jin等利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)篩選Mpro抑制劑，測(cè)定了 10 000 多種藥物或活性化合物，并利用LC-MS/MS分析確定依布硒啉、PX-12和卡莫呋對(duì)Mpro的共價(jià)結(jié)合。Ma等將非變性質(zhì)譜(native MS)用于Mpro與4種潛在抑制劑(波普瑞韋、GC-376以及鈣蛋白酶抑制劑II和XII)的結(jié)合表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此4種化合物均能明顯抑制SARS-CoV-2在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。Maisonnasse等基于LC-MS/MS研究了羥氯喹(HCQ)在體外和SARS-CoV-2感染獼猴中的抗病毒活性，通過(guò)定量分析血清、血液以及肺組織中HCQ含量，發(fā)現(xiàn)HCQ沒(méi)有明顯的預(yù)防感染能力。

2.2 復(fù)雜基質(zhì)單一成分鑒定

Dai研究組針對(duì)SARS-CoV-2主要蛋白酶Mpro設(shè)計(jì)合成了兩種先導(dǎo)化合物11a和11b, 通過(guò)HPLC鑒定其純度，分別為99.88%和99.20%,這兩種化合物在體內(nèi)均表現(xiàn)出有效的抗SARS-CoV-2感染活性，可作為候選藥物用于后續(xù)臨床研究。Monteil等使用HPLC鑒定了鼠源重組ACE2,并比較了鼠源重組與人重組ACE2在SARS-CoV-2抗感染方面的差異。結(jié)果表明，人重組ACE2可顯著降低細(xì)胞和多種人體器官模型的病毒感染，而鼠源重組ACE2則沒(méi)有此效果。在對(duì)患病程度不同的新冠病人及健康人員血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析后，Shen等利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)從血清中分離鑒定并定量了894種蛋白質(zhì)和941種代謝物(包括36種藥物及其代謝物),揭示了重癥患者血清中特征蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的變化，為疾病嚴(yán)重程度評(píng)估提供參考。

3 磁珠分離

磁珠分離技術(shù)可通過(guò)磁性顆粒表面修飾的官能團(tuán)或特異性抗體，從復(fù)雜基質(zhì)中選擇性結(jié)合靶標(biāo)分子，并在外磁場(chǎng)輔助下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物富集，其分離效率高、重復(fù)性好，但提取效率低且價(jià)格較高。當(dāng)前，磁珠分離技術(shù)仍是新型冠狀病毒分離的主要方法，且有多款基于磁微粒-化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)試劑盒通過(guò)國(guó)家藥監(jiān)局審批。該試劑盒采用雙抗原夾心原理，形成化學(xué)發(fā)光劑/抗原-抗體-磁顆粒/抗原復(fù)合物，在磁場(chǎng)輔助下分離結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物，隨后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量或定性分析。磁珠分離技術(shù)還能與病毒核酸自動(dòng)化提取設(shè)備配套使用，對(duì)大批量樣本的核酸進(jìn)行提取，方法操作簡(jiǎn)單，極大節(jié)約了時(shí)間和人工成本，可顯著提高核酸的檢測(cè)效率。

在新型冠狀病毒研究中，磁珠分離技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)胞分離、核酸提取和免疫學(xué)檢測(cè)。Cao等利用免疫磁珠從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中負(fù)選分離到B細(xì)胞，并用結(jié)合腫瘤壞死因子受體超家族7(CD27)抗體的磁珠進(jìn)一步分離得到CD27+記憶B細(xì)胞，通過(guò)高通量單B細(xì)胞測(cè)序?qū)π鹿诳祻?fù)期患者體內(nèi)中和抗體進(jìn)行鑒定。Zhao等在磁性納米顆粒上涂覆了一層聚(氨基酯)-羧基，利用核酸與羧基之間強(qiáng)相互作用提取SARS-CoV-2的RNA。該方法將病毒遺傳物質(zhì)裂解、提取和結(jié)合步驟組合到一起，得到的納米顆粒-RNA復(fù)合物不需要額外洗脫即可引入后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR),極大提高COVID-19的診斷效率。Fabiani研究組以磁珠為免疫載體，堿性磷酸酶為免疫標(biāo)記二抗，開發(fā)了一種唾液中SARS-CoV-2快速檢測(cè)的電化學(xué)免疫分析法。所建方法可用于唾液臨床樣本中S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)的檢測(cè)，檢出限分別為19 ng/mL 和8 ng/mL。

4 離心

離心技術(shù)操作簡(jiǎn)易，成本較低，是通過(guò)控制離心機(jī)轉(zhuǎn)速實(shí)現(xiàn)樣品中蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞亞組分的分離。作為最基礎(chǔ)的分離技術(shù)，離心技術(shù)在新型冠狀病毒檢測(cè)中可用來(lái)分離血漿中的血清，用于抗體和抗原的檢測(cè)。在新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室研究環(huán)節(jié)，通過(guò)離心技術(shù)可分離鼻咽拭子中顆粒物質(zhì)以及未消化的死細(xì)胞和纖維碎片，并反復(fù)離心清洗來(lái)沉淀純化病毒核酸。相比于普通離心技術(shù)，超速離心技術(shù)具有更強(qiáng)的離心力場(chǎng)，可迅速實(shí)現(xiàn)小顆粒(如病毒顆粒、蛋白質(zhì)等)的沉降分離。Bao等使用超速離心從Vero E6病變細(xì)胞中沉淀獲得病毒顆粒，研究了SARS-CoV-2在表達(dá)人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠中的致病性。Zost等將超速離心用于S蛋白假型慢病毒的分離，來(lái)測(cè)定兩種單克隆抗體的中和能力，結(jié)果顯示假病毒比野生型病毒具有更敏感的中和表型，證明在單克隆抗體效果測(cè)定中使用活病毒的必要性。此外，聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度離心技術(shù)也被用于分離PBMC,以研究普通冠狀病毒和SARS-CoV-2的免疫學(xué)差異。

5 微納分離

材料科學(xué)和電子技術(shù)的進(jìn)步帶動(dòng)了微納分離技術(shù)發(fā)展，使其成為生物樣品分析的重要技術(shù)手段。微流控技術(shù)具有微型尺寸、樣品量小、快速擴(kuò)散、比表面積大等優(yōu)勢(shì)，常與其他技術(shù)結(jié)合，用于SARS-CoV-2相關(guān)蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)。Lin等開發(fā)了一種微流控免疫芯片，結(jié)合自制熒光檢測(cè)器分析檢測(cè)了SARS-CoV-2 3種生物標(biāo)志物(IgG、IgM和抗原)。該方法快速、靈敏、便捷，在15 min內(nèi)即可完成SARS-CoV-2檢測(cè)。Xiong研究組基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP),開發(fā)了一種便攜式LAMP-微流控集成系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用小型圓盤狀微流控芯片(81 mm),可在40 min內(nèi)同時(shí)識(shí)別7種已知人類冠狀病毒。Funari等將電沉積方法用于一種光微流體傳感平臺(tái)開發(fā)，通過(guò)比較金納米釘在抗原-抗體結(jié)合時(shí)局部折射率變化，在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)1 μL血清樣品中SARS-CoV-2 S蛋白特異性抗體測(cè)定，檢出限低至0.08 μg/L(～ 0.5 pmol/L)。Tan研究組提出了一種便攜式化學(xué)發(fā)光微流體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)，從候選蛋白質(zhì)中篩選出對(duì)SARS-CoV-2 S1蛋白具有高親和力和特異性的D006作為校準(zhǔn)抗體，在15 min內(nèi)可對(duì)血清中低至2 ng/mL 的S1特異性IgG進(jìn)行定量評(píng)估。此技術(shù)還被用于S1和N蛋白的高靈敏檢測(cè)(40 min),檢出限分別為4 pg/mL 和62 pg/mL。Lakshmanan等將微流控芯片技術(shù)用于體外抗凝治療的止血效果評(píng)估，設(shè)計(jì)了一種具有兩條正交通道的微流控裝置，其中一條通道作為血管模型，另一條通道用來(lái)模擬損傷部位止血塞的形成，用于識(shí)別潛在的抗凝靶點(diǎn)和試驗(yàn)藥物，以此減輕COVID-19相關(guān)的血栓并發(fā)癥。

6 電泳

電泳技術(shù)利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的技術(shù)，是生命分析領(lǐng)域重要分離手段之一。然而，在新型冠狀病毒研究中電泳的許多應(yīng)用均可被分子生物學(xué)方法替代，且在實(shí)際檢測(cè)中相比于自動(dòng)化設(shè)備和商品化試劑盒，其技術(shù)要求高，因而應(yīng)用有限，亟待后續(xù)研究拓展。其中，瓊脂糖凝膠電泳(AGE)是應(yīng)用較多的電泳技術(shù)，常被用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物分析。Kim等對(duì)SARS-CoV-2的RNA基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，并用AGE方法驗(yàn)證了測(cè)序發(fā)現(xiàn)的亞基因組RNA(sgRNAs),進(jìn)而揭示基因在RNA基因組上的確切位置。Meza-Robles等提出一步嵌套式RT-PCR,不需要實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀，通過(guò)AGE即可實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒的定量檢測(cè)。該技術(shù)使用4個(gè)物種特異性的診斷引物，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)特定區(qū)域擴(kuò)增和陽(yáng)性對(duì)照。Si等對(duì) 2 188 例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子樣本進(jìn)行分析，使用RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2, PCR片段分析結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)12種病毒，以研究SARS-CoV-2和常見(jiàn)呼吸道病毒的流行病學(xué)規(guī)律，以此提高疑似COVID-19患者的診斷效率。

7 結(jié)論

新型冠狀病毒研究已取得一定進(jìn)展，分離技術(shù)在其中發(fā)揮著重要作用。其中，AC和SEC廣泛用于病毒相關(guān)蛋白質(zhì)純化中；精密儀器制造業(yè)的發(fā)展，促使HPLC分離效率的提升，是完成高靈敏度、快速解決病毒代謝組學(xué)分析的關(guān)鍵手段；新材料和電子技術(shù)的進(jìn)步，帶動(dòng)磁珠和微納分離技術(shù)的靈敏度提升和應(yīng)用范圍拓展，尤其是對(duì)化學(xué)試劑消耗降低，實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境的友好，是解決細(xì)胞分析、核酸分離和免疫學(xué)檢測(cè)的首選技術(shù)；傳統(tǒng)的離心技術(shù)在病毒顆粒和細(xì)胞分離中發(fā)揮著不可替代的作用；電泳技術(shù)主要用于PCR產(chǎn)物分析。

當(dāng)前，新型冠狀病毒檢測(cè)的難點(diǎn)主要集中在“假陽(yáng)性”和“假陰性”結(jié)果上。作為新型冠狀病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,核酸檢測(cè)能檢測(cè)出處于窗口期的患者，但病毒載量差異、樣品采集、診斷試劑質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)操作等問(wèn)題會(huì)導(dǎo)致“假陰性”結(jié)果；抗體檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快捷，可作為核酸檢測(cè)假陰性的有效補(bǔ)充，但其對(duì)靈敏度和特異性要求高，靈敏度低會(huì)產(chǎn)生“假陰性”結(jié)果，特異性低則會(huì)產(chǎn)生“假陽(yáng)性”結(jié)果。分離技術(shù)作為新型冠狀病毒檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)，可分離純化復(fù)雜基質(zhì)中病毒顆粒、核酸和蛋白質(zhì)，減少基質(zhì)中干擾物質(zhì)帶來(lái)的“假陽(yáng)性”結(jié)果；同時(shí)，分離技術(shù)與新型檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，可進(jìn)一步提高病毒相關(guān)蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏性和特異性，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，分離技術(shù)在新型冠狀病毒研究和防疫檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。這些分離技術(shù)各具特色，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用合適的分離技術(shù)，靈活組合，能有效推動(dòng)新型冠狀病毒檢測(cè)、疫苗和創(chuàng)新療法的研發(fā)，使疫情早日得到控制。

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