目的 建立黃蛭益腎膠囊HPLC指紋圖譜，采用指紋圖譜并結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)對黃蛭益腎膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制。方法 采用Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm。采用HPLC串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS/MS）對共有峰定性分析，采用聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）統(tǒng)計分析。結(jié)果 16批樣品中共標(biāo)定24個共有峰，相似度評價均大于0.9，鑒定了其中24個峰并歸屬于7味藥；HCA及PCA識別方法將樣品分為3類；PLS-DA篩選出包括黃芪異黃烷苷、人參皂苷Rg1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、7,2'-二羥基-3',4'-二甲氧基異黃烷、松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、綠原酸在內(nèi)的8種主要差異成分。結(jié)論 建立的HPLC指紋圖譜可最大程度反映黃蛭益腎膠囊的藥味組成信息，較全面反映其質(zhì)量，應(yīng)用的評價分析技術(shù)可合理評價其質(zhì)量差異并準(zhǔn)確尋找出差異成分，為其質(zhì)量合理控制和標(biāo)準(zhǔn)完善提供依據(jù)。

黃蛭益腎膠囊由黃芪、水蛭、枸杞子、牛膝、車前子、山藥、薏苡仁、玄參、墨旱蓮、杜仲、三七、益母草、北沙參、蟬蛻、紫河車15味藥材組成，根據(jù)著名腎病學(xué)家鄒云翔教授獨(dú)創(chuàng)的經(jīng)驗(yàn)方精制而成，功效補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾益腎、化瘀利水，用于輕、中度慢性原發(fā)性普通型腎炎的氣陰兩虛或兼有血瘀，水濕證者。黃蛭益腎膠囊藥味眾多，性質(zhì)各異，化學(xué)成分復(fù)雜，該制劑目前的研究主要在臨床應(yīng)用方面，缺乏對其質(zhì)量控制方面的研究?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡單，質(zhì)量控制不全面，方法也較為落后，定量指標(biāo)單一，不能表征黃蛭益腎膠囊的整體化學(xué)組成，難以對藥品進(jìn)行全面的質(zhì)量控制，這樣勢必影響臨床用藥的有效性。

中藥指紋圖譜的特點(diǎn)包括整體性、特征性及可量化等方面，突出中藥的完整面貌，在研究中藥有效成分、控制中藥質(zhì)量以及鑒別方面的作用越來越突出?；瘜W(xué)模式識別技術(shù)可將指紋圖譜信息數(shù)量化，客觀反映中藥質(zhì)量信息，包括聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）、判別分析（DA）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)（ANN）等，是一種有效評價中藥質(zhì)量的方法。中藥指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別，是中藥真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評價的有力手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥材及制劑的質(zhì)量控制方面。本研究首次采用HPLC建立黃蛭益腎膠囊的指紋圖譜，應(yīng)用HPLC-Q-TOF-MS/MS對其共有成分進(jìn)行定性分析，并結(jié)合HCA、PCA、和PLS-DA對其進(jìn)行質(zhì)量評價并發(fā)現(xiàn)造成不同批次間質(zhì)量差異的因素，為黃蛭益腎膠囊質(zhì)量控制和完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

高效液相色譜儀Ulti Mate3000（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Bruker四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；XSE105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Thermo Heraeus Multifuge X3離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；KUDOS超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q®型超純水儀（美國密理博公司）。

對照品：松脂醇二葡萄糖苷（批號111537-20160501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.7%），購自中國食品藥品檢定研究院；7,2'-二羥基-3',4'-二甲氧基異黃烷（批號Y28M10H84303，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、黃芪異黃烷苷（批號Y08S8H43409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、美迪紫檀苷（批號P21N9F75533，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號Y27F9H54731，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芒柄花苷（批號R28O8F46957，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、毛蕊異黃酮（批號Y24N9Y75652，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；芒柄花黃素（批號MUST-18033005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.03%），購自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

黃蛭益腎膠囊16批樣品、處方中每味藥的原藥材（經(jīng)蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心閔春艷主任中藥師鑒定合格）、缺單味藥的黃蛭益腎膠囊陰性樣品均由蘇州雷允上藥業(yè)有限公司提供。16批樣品編號S1～S16，相應(yīng)批號分別為OC26002、PC26002、QC26001、RC26003、RC26004、RC26005、RC26006、RC26007、RC26008、RC26009、RC26010、RC26011、SC26001、SC26005、SC26006、SC26007。

2 方法

2.1 色譜條件

以Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）為色譜柱；流動相為乙腈（A)-0.05%磷酸水（B）；梯度洗脫程序：0～5 min、5%A,5～85 min、5%～45%A；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積10μL；檢測波長210 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子掃描模式，掃描范圍m/z 50～1 500，干燥氣溫度180℃，干燥器體積流量6 L/min，霧化器壓力150 k Pa，毛細(xì)管電壓4.5 k V，裂解電壓500 V，碰撞能量35.0 e V。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備

精密稱定本品粉末約2 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 m L，超聲處理（功率100 W，頻率52 k Hz)30 min，取出，放冷，上清液過0.45μm的濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備

取松脂醇二葡萄糖苷、7,2'-二羥基-3',4'-二甲氧基異黃烷、黃芪異黃烷苷、美迪紫檀苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為18.00、8.40、21.20、8.40、20.08、15.94、29.28、16.92 mg/L的混合對照品溶液。

2.3.3 藥材溶液的制備

取黃芪、水蛭、枸杞子、牛膝、車前子、山藥、薏苡仁、玄參、墨旱蓮、杜仲、三七、益母草、北沙參、蟬蛻、紫河車各2 g，同“2.3.1”項(xiàng)下方法制備成單味藥供試品溶液。

2.3.4 缺單味藥的陰性樣品溶液的制備

分別取缺單味藥的陰性樣品2 g，同“2.3.1”項(xiàng)下方法制備成陰性樣品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

按“2.3.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測定。以16號峰毛蕊異黃酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<0.38%、3.97%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液（S1)6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以16號峰毛蕊異黃酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<0.24%、4.35%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.3.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、3、6、12、18、24 h進(jìn)樣測定。以毛蕊異黃酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<0.24%、4.57%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 耐用性試驗(yàn)

取同一批樣品溶液（S1），分別選取同一色譜柱Waters XBridge®Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm）的不同批號進(jìn)樣，批號分別為0135383132、0136392001、0137392827，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以毛蕊異黃酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD<0.39%、6.94%。

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