3 討論

3.1 儀器條件選擇

3.1.1 MS/MS特征離子的選擇

對于動物肌肉組織中多種甾體激素的分析，采用串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式采集信號。在ESI⁺電離方式下，11種甾體激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]⁺準(zhǔn)分子離子峰，然后進行相應(yīng)的子離子全掃描，以確定MRM特征診斷離子，11種甾體激素選擇的特征離子見表1,每種藥物選擇兩個離子對。

3.1.2 液相條件的優(yōu)化

基于超高效液相色譜分離的特點和要求，在優(yōu)化的流動相條件下，11種甾體激素藥物在 15 min內(nèi)實現(xiàn)良好的分離，峰形對稱，不拖尾，圖1為11種激素在豬肉中的MRM離子流色譜圖。考慮到同化激素容易受到內(nèi)源性干擾，選用的色譜柱不宜過短，因此選擇了長度為150 mm的色譜柱。11種同化激素在溫度高于45 ℃時易于分解，而色譜柱溫度較低時分離洗脫效果較低，且出峰較慢。流動相中加入適量的甲酸溶液有利于11種激素都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子。試驗對比了有機溶劑乙腈/甲醇(A相)與水/0.1%甲酸水溶液(B相)分離目標(biāo)化合物的效果。在0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈流動體系中，采用梯度洗脫，可實現(xiàn) 11種甾體激素藥物的快速分離，且峰形良好。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

3.2.1 除脂

動物組織含有的脂肪會影響檢測方法的靈敏度，本研究對比了使用乙腈飽和的正己烷和低溫冷凍兩種方法以及兩種方法相結(jié)合的除脂效果。當(dāng)使用乙腈飽和的正己烷進行除脂，結(jié)果表明丙酸睪酮和丙酸諾龍的回收率均低于30%,而苯丙酸諾龍幾乎檢測不到，且其余8種藥物的回收率相對于用冷凍除脂的方法也有所降低，因此選擇冷凍除脂。

3.2.2 提取溶劑的選擇

試驗對比了叔丁基甲醚、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等溶劑或混合溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)叔丁基甲醚提取時，康力龍、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍的回收率低于30%。乙酸乙酯提取時，康力龍、苯丙酸諾龍的回收率低于55%。以甲醇-乙腈(1∶1,v/v)提取時各個藥物的回收率較高，且易于濃縮，最終選擇甲醇-乙腈(1∶1,v/v)作為提取液。

3.2.3 固相萃取法的優(yōu)化

3.2.3.1 固相萃取柱的選擇

考慮到經(jīng)有機試劑提取肌肉組織容易得到較多雜物，本試驗采用最常用的凈化方式固相萃取凈化。由于類物質(zhì)為中等極性或者弱極性，目前報道中多采用MCX、HLB和C₁₈固相萃取小柱。本試驗對比了11種同化激素在MCX、HLB和C₁₈兩種固相萃取小柱上吸附效果，當(dāng)使用 MCX 柱進行凈化時，大部分藥物的回收率低于30%。與HLB固相萃取柱相比，各個藥物在C₁₈固相萃取柱上回收率均較高，同時考慮其成本相對較低，最終選擇C₁₈柱。

3.2.3.2 淋洗液的選擇

在固相萃取過程中，需要盡可能地洗掉的干擾組分，且需保證所測目標(biāo)化合物不被洗脫下來。本試驗所測目標(biāo)化合物易溶于甲醇，選用的固相萃取柱的淋洗溶劑一般采用甲醇，因此，本研究采用加入含所測藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白樣品進行試驗，選擇不同濃度的甲醇水作為淋洗溶液，比較淋洗效果。試驗結(jié)果表明，當(dāng)淋洗液為20%甲醇水淋洗的目標(biāo)化合的回收率相對較高，30%甲醇水淋洗液的回收率稍偏高；另外，隨著甲醇的含量增加，即甲醇含量高于30%時，目標(biāo)化合物未被固相萃取柱保留而導(dǎo)致回收率降低。主要原因由于目標(biāo)化合物能溶解于有機試劑甲醇中，在淋洗過程中，隨著甲醇的含量的增加，其洗脫的能力也增加，因此，造成目標(biāo)化合物在淋洗過程中被沖洗，造成了回收率的降低，最終選取30%甲醇作為淋洗溶液。

3.2.3.3 洗脫液的選擇

本試驗選用甲醇、乙腈及混合溶劑甲醇/乙腈(1∶1,v/v)對目標(biāo)化合物進行洗脫。試驗結(jié)果表明，在洗脫劑用量不變的條件下，甲醇與乙腈的洗脫能力相當(dāng)，乙腈稍高于甲醇的洗脫能力；而當(dāng)選擇甲醇作為洗脫液時，群勃龍和勃地龍的回收率相對于乙腈洗脫時低，且雜質(zhì)增多；以混合溶劑甲醇/乙腈(1∶1,v/v)對目標(biāo)化合物進行洗脫時，洗脫速度相對較慢，雜質(zhì)也相對較多，因此，最終選擇乙腈溶液作為最佳洗脫溶劑。

本試驗對洗脫溶劑乙腈不同洗脫體積(2 mL,3 mL,4 mL,5 mL)對目標(biāo)化合物的洗脫能力，試驗結(jié)果表明，當(dāng)洗脫液體積為2 mL 時，整體目標(biāo)化合物的回收率較低；當(dāng)升高洗脫溶劑至3 mL 時，其回收率相對增加；當(dāng)采用5 mL洗脫液體積時，回收率有降低的趨勢；洗脫液的體積與氮吹濃縮的時間有關(guān)，故在一定程度上影響了前處理的時間。因此，考慮回收率與經(jīng)濟實惠等因素，最終選定4 mL洗脫液體積為最佳選擇。

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定11種同化激素的方法，以豬肉、雞肉為檢測基質(zhì)，證明了方法的可應(yīng)用性，為肉品中同化激素的檢測提供了可選擇的方法。

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