3.2補(bǔ)陽還五湯及其給藥人血漿、尿液藥物化學(xué)成分鑒定

本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)補(bǔ)陽還五湯及其給藥人血漿和尿液藥物化學(xué)成分進(jìn)行了分析，在分析過程中根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、分子離子特征碎片峰及其碎裂規(guī)律，在補(bǔ)陽還五湯中共鑒定了55個(gè)化合物；給藥后人的血漿中鑒定了34個(gè)化合物；在尿液中鑒定了23個(gè)化合物，結(jié)果見表1。

3.3補(bǔ)陽還五湯主要藥物化學(xué)成分的裂解規(guī)律

黃酮類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液中黃酮及其苷類化合物的數(shù)量較多，且在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，例如牡荊素、紅橘素、木犀草素和毛蕊異黃酮及其苷類。以補(bǔ)陽還五湯中主要活性成分毛蕊異黃酮苷為例，其色譜保留時(shí)間為8.72 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 447.127 8[M+H]+，產(chǎn)生的二級(jí)特征離子碎片有m/z 285.075 1[M+H-C6H10O5]+為毛蕊異黃酮苷脫去1個(gè)葡萄糖后的特征碎片離子，m/z166.984 3[M+H-C13H14O7]?為毛蕊異黃酮苷的基本母核經(jīng)碎裂后得到的離子碎片。毛蕊異黃酮苷對(duì)照品提取離子流色譜圖(extracted ion chromatogram,XIC)和在湯劑中質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖2~3。

苯酸類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液中苯酸類化合物的數(shù)量較多，且在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，例如阿魏酸、綠原酸、沒食子酸和高藜蘆酸等。以補(bǔ)陽還五湯中主要活性成分阿魏酸為例，其色譜保留時(shí)間為7.12 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 195.065 0[M+H]+，產(chǎn)生的二級(jí)特征離子碎片有m/z 177.054 5[M+H-H2O]+為阿魏酸脫去1個(gè)H2O后的特征碎片離子，m/z 149.012 1[M+H-H2O-CO]+為阿魏酸脫去1個(gè)H2O后再脫去1個(gè)CO的特征碎片離子。阿魏酸對(duì)照品XIC圖和在湯劑中質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖4~5。

苯酞類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液中苯酞類化合物的數(shù)量較多，且在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，例如洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯H等。以補(bǔ)陽還五湯中主要活性成分洋川芎內(nèi)酯H為例，其色譜保留時(shí)間為10.05 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z225.118[M+H]+，產(chǎn)生的二級(jí)特征離子碎片有m/z207.101 4[M+H-H2O]+為洋川芎內(nèi)酯H脫去1個(gè)H2O后的特征碎片離子，m/z 189.090 8[M+H-2H2O]+為洋川芎內(nèi)酯H脫去2H2O個(gè)的特征碎片離子。洋川芎內(nèi)酯H對(duì)照品XIC圖和在湯劑中質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖6~7。

皂苷類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯主要活性成分黃芪皂苷Ⅲ，其在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，色譜保留時(shí)間為13.19 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 783.455 7[M-H]?和m/z 843.477 7[M+CH3COO]?，產(chǎn)生的二級(jí)特征離子碎片有m/z621.063 5[M-H-C6H10O5]+為黃芪皂苷Ⅲ脫去1個(gè)葡萄糖后的特征碎片離子，m/z 469.051 0[M-HC6H10O5-C5H9O4-H2O-2H]?為黃芪皂苷Ⅲ脫去1個(gè)葡萄糖，脫去1個(gè)木糖，1個(gè)水和2個(gè)氫后的特征碎片離子，此碎裂規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道一致，黃芪皂苷Ⅲ對(duì)照品XIC圖和在湯劑中黃芪皂苷Ⅲ[M-H]?質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖8~9。

4討論

本研究建立的檢測(cè)方法在16 min完成了補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液中的藥物化學(xué)成分的檢測(cè)，一共鑒定了61個(gè)化合物。本研究采用的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)，與文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC-DAD-TOF/MS和UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)相比，具有更快的分析速度、更高的準(zhǔn)確度和靈敏度。本研究在人的血漿中分析鑒定了34個(gè)化合物，尿液中分析鑒定了23個(gè)化合物。這些成分主要是黃酮、苯酸和苯酞，這與文獻(xiàn)豬的血清中主要成分存在一定的差異，豬的血清中主要成分以黃酮類化合物為主，其他化合物并沒有檢測(cè)到，這可能是當(dāng)時(shí)的技術(shù)平臺(tái)和人與動(dòng)物之間的吸收和代謝差異引起的。在人的血漿中和尿液中鑒定的化合物已被證明具有治療腦卒中的作用，如黃酮類化合物的蘆丁、毛蕊異黃酮、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷和槲皮素等在體外已經(jīng)證明其可降低損傷大鼠腦細(xì)胞流動(dòng)性。苯酸類化合物阿魏酸、綠原酸、沒食子酸等具有降低主動(dòng)血管炎癥、改善急性心肌缺血、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能而降低神經(jīng)細(xì)胞損傷等作用。苯酞類成分洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯H等具有在抗氧化損傷、抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝及抗血小板聚集、舒張血管等作用。結(jié)合各單個(gè)化合物藥理活性相關(guān)報(bào)道，初步推斷人血漿和尿液的藥效成分可能為補(bǔ)陽還五湯在人體內(nèi)發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥進(jìn)入體內(nèi)后發(fā)揮藥效的物質(zhì)有可能是藥物原型，也會(huì)是藥物的代謝產(chǎn)物。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯的各個(gè)成分進(jìn)入人體后，在血漿樣本和尿液樣本中檢測(cè)的代謝產(chǎn)物相對(duì)較少。目前還未見對(duì)補(bǔ)陽還五湯吸收進(jìn)入人體后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)一步研究補(bǔ)陽還五湯進(jìn)入人體后的代謝產(chǎn)物和其代謝途徑，為進(jìn)一步揭示補(bǔ)陽還五湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)參考。

本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)完成了補(bǔ)陽還五湯和其給藥后在人血漿及尿液中藥物化學(xué)的快速分析，為揭示補(bǔ)陽還五湯治療缺血性腦卒中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。

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