目的應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)技術(shù)鑒定補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液中藥物化學(xué)成分。方法采集補(bǔ)陽還五湯及其臨床患者口服給藥后的血漿和尿液樣本，樣本經(jīng)80%甲醇水處理后，采用Hyperil Gold C18色譜柱(1.0 mm×50 mm，1.9μm)，流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)(各含0.1%甲酸和5 mmol·L?1醋酸銨)進(jìn)行梯度洗脫，流速0.3 mL·min?1，柱溫40℃。通過對(duì)比分析補(bǔ)陽還五湯、給藥后人血漿和給藥后人尿液樣本，同時(shí)結(jié)合化合物的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，表征其制劑、含藥血漿和尿液中藥物化學(xué)成分。結(jié)果在湯劑中共鑒定了55個(gè)化合物；在給藥后患者的血漿中共鑒定了34個(gè)化合物；在尿液中鑒定了23個(gè)化合物。這些成分主要是黃酮類、苯酸類、苯酞類和皂苷類化合物。結(jié)論本研究全面闡明了補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液藥物化學(xué)成分，為揭示補(bǔ)陽還五湯真正治療腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。

補(bǔ)陽還五湯由黃芪生、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等7味常見中藥組成，是益氣活血的代表方[1]。補(bǔ)陽還五湯常用于治療腦血管意外后遺癥中缺血性腦卒中。藥理研究證明，補(bǔ)陽還五湯可以減少脊髓損傷部位的細(xì)胞凋亡[4]，促進(jìn)腦缺血后血管生成，降低血管細(xì)胞黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，降低C-反應(yīng)蛋白和血脂水平，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用等。補(bǔ)陽還五湯治療缺血性腦卒中藥效確切，但是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是闡釋中藥整體功效及作用本質(zhì)的核心環(huán)節(jié)，目前對(duì)補(bǔ)陽還五湯和其在體內(nèi)的藥物化學(xué)的鑒定分析已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，如Liu等利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-DAD-TOF/MS)技術(shù)結(jié)合化合物精確分子離子和特征碎片離子在補(bǔ)陽還五湯中一共鑒定了54個(gè)化合物，主要是喹諾酮類、黃酮類、異黃酮類、單萜苷類、皂苷類、有機(jī)酸和氨基酸。在體內(nèi)的相關(guān)研究如沈曉等利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)結(jié)合精確相對(duì)分子質(zhì)量和特征碎片離子對(duì)大鼠灌胃補(bǔ)陽還五湯后的腦組織中共檢測(cè)到5個(gè)化合物，在血漿中檢測(cè)到7個(gè)化合物，同時(shí)楊東輝等[10]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-DADitrap/MS)結(jié)合化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量、特征碎片離子和紫外吸收特征在豬的血清中共鑒定了45個(gè)化合物，上述研究均為揭示補(bǔ)陽還五湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是其在臨床上的相關(guān)研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，而藥物只有進(jìn)入人體后才能發(fā)揮藥效，故對(duì)補(bǔ)陽還五湯在人體內(nèi)的藥物化學(xué)研究，更有益于闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用的超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，建立此分析方法對(duì)補(bǔ)陽還五湯及其在人血漿和尿液藥物化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，將為揭示其治療缺血性腦卒中的物質(zhì)基礎(chǔ)提供更加有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

Vanquish UHPLC超高效液相色譜儀、QE-HF-X型質(zhì)譜儀、ST16R型冷凍離心機(jī)均來自美國(guó)Thermo公司；血漿采血管(美國(guó)BD公司)；尿杯(上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司)；甲醇、水、甲酸、醋酸銨(LC-MS級(jí))均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，其他試劑均為分析純。補(bǔ)陽還五湯嚴(yán)格遵照原方黃芪生120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍415 g，地龍、川芎、桃仁、紅花各3 g配比水煎而成。阿魏酸(批號(hào)：EB04168；純度≥99%)、毛蕊異黃酮苷(批號(hào)：EB07531；純度≥98%)對(duì)照品均購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司；黃芪皂苷Ⅲ(批號(hào)：B20567；純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯H(批號(hào)：B21462；純度≥98%)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

2方法

2.1臨床樣本采集

隨機(jī)選取6名被診斷為腦卒中患者(男女各半)，禁食4 h，服用補(bǔ)陽還五湯后，分別在1，2 h采集患者的血漿和尿液樣本，血漿和尿液離心(3 000 r·min?1，10 min)，取上清液約0.5 mL，混合不同時(shí)間點(diǎn)的血漿和尿液樣本后冷凍保存于?80℃，備用。

2.2樣本前處理

分別取補(bǔ)陽還五湯、解凍后的血漿和尿液樣本100μL至EP管中，加入400μL含0.1%甲酸甲醇溶液，渦旋震蕩1 min，冰浴靜置5 min，以15 000 r·min?1、4℃下離心10 min，取300μL上清液加LC-MS級(jí)水稀釋至500μL，使用含有0.22μm濾膜的離心管中以10 000 r·min?1、4℃下離心10 min，收集濾液，進(jìn)樣分析。

2.3對(duì)照品工作液配制

精密稱取適量的阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、黃芪皂苷Ⅲ和洋川芎內(nèi)酯H對(duì)照品，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別配成質(zhì)量濃度為10.0，10.0，20.0，10.0 mg·mL?1的儲(chǔ)備液。分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一個(gè)10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋配制對(duì)照品混合工作液，保存于?20℃冰箱。

2.4 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS分析

色譜柱為Hyperil C18(1.0 mm×50 mm，1.9μm)；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)(各含0.1%甲酸和5 mmol·L?1醋酸銨)；流速為0.30 mL·min?1；進(jìn)樣量為2μL。梯度洗脫：0~2 min，2%B，2~12 min，2%→100%B，12~14 min，100%B，14~14.1 min，100%→2%B，14.1~16 min，2%B。掃描范圍選擇m/z 100~1 500；ESI源：毛細(xì)管電壓為3.2 kV；鞘氣流速：35 arb；輔助氣體流速：10 arb；毛細(xì)管溫度：320℃。MS/MS二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。

2.5補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分和其在人血及尿液中藥物化學(xué)成分的鑒定

采用LC/MS條件對(duì)補(bǔ)陽還五湯樣品和人血及尿液樣品進(jìn)行檢測(cè)分析。通過比較補(bǔ)陽還五湯樣品、給藥組血漿和尿液的總離子流圖和化合物質(zhì)譜碎裂規(guī)律鑒定藥物化學(xué)成分，并對(duì)主要成分采

3結(jié)果

3.1 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS色譜圖的采集

根據(jù)建立的測(cè)試分析方法，在正、負(fù)離子模式下采集補(bǔ)陽還五湯樣品和給藥人血漿及尿液樣品的色譜圖，結(jié)果見圖1。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)》2020年7月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

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