茯磚茶是以黑毛茶為原料，經(jīng)氣蒸、渥堆、樂磚、發(fā)花(發(fā)酵)和干燥等工序加工而成。“發(fā)花”是茯磚茶獨(dú)特的加工工序，其實(shí)質(zhì)是通過控制環(huán)境溫濕度促使優(yōu)勢(shì)微生物冠突散囊菌大量生長(zhǎng)繁殖形成“金花”，進(jìn)而催化茶葉內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，形成茯磚茶特有的品質(zhì)風(fēng)味。“金花”的數(shù)量和質(zhì)量是判別茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要特征性指標(biāo)。

香氣是決定茶葉品質(zhì)最重要的關(guān)鍵因素之一。茯磚茶香氣成分以醇類、醛類、酮類等化合物為主。茯磚茶特征香氣“菌花香”是一種復(fù)合型香氣類型，是在黑毛茶香氣基礎(chǔ)上，增加了陳香、花香和火功香，最終協(xié)調(diào)而成。有研究表明.經(jīng)“發(fā)花”工序后，茯磚茶中酮類、萜烯醇類、酮類、雜氧類化合物含量顯著增加，推測(cè)這些揮發(fā)性成分的增加與茯磚茶特征香氣形成有關(guān)。但是，茯磚茶特征香氣的呈香物質(zhì)種類以及來源鮮見詳細(xì)報(bào)道。

本研究中以茯磚茶及其分離的“金花”菌體和去“金花”純茶為研究對(duì)象，采用感官審評(píng)、固相微萃取(Solidphasemicroextraction，SPME)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gaschromatograph-massspectrometer，GC-MS)、香氣活力值(0doractivevalues，0AV)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，研究茯磚茶特征香氣的呈香物質(zhì)及其來源，以期為“菌花香”的形成機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品及制備

湖南益陽茶廠有限公司生產(chǎn)的機(jī)制茯磚茶購(gòu)于長(zhǎng)沙縣星沙鎮(zhèn)中壺茶行。將整塊茯磚茶破碎成小塊，采用茶針將茶葉中“金花”輕輕挑下，使茶葉與“金花”分離，并過100目篩，得到茯磚茶、去“金花”純茶和“金花”菌體3種待測(cè)樣品，如圖1所示。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

C8～C40偶數(shù)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)02si公司產(chǎn)品；癸酸乙酯、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、雪松醇、苯甲醛、苯乙酮、β-紫羅酮、水楊酸甲酯：美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司產(chǎn)品；α-松油醇、芳樟醇、苯乙醇、香葉醇、己醛、庚醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、β-環(huán)檸檬醛、癸醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、茶香酮、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、對(duì)甲基苯乙酮、α-紫羅酮、2-十-烷酮、香葉基丙酮、萘、2-甲基萘、1-甲基萘、1，2，3-甲氧基苯、二苯并呋喃、棕櫚酸乙酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚：北京J&K公司產(chǎn)品：香葉酸甲酯：上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；乙醇(色譜純)、氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

7890B/7693型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、65μmPDME/DVB固相微萃取頭：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品；AE240型電子天平：瑞士Mettler公司產(chǎn)品；984TA7CHSEUA型陶瓷加熱面板磁力攪拌器：美國(guó)Talbovs公司產(chǎn)品：LDP-350型高速多功能粉碎機(jī)：浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感官審評(píng)

根據(jù)GB/T23776-2018《茶葉感官審評(píng)方法》中的方法，由5名專業(yè)人員對(duì)樣品的外形、湯色、香氣、滋味進(jìn)行感官審評(píng)。

1.2.2 固相微萃取法

參考xu等的方法。將固相微萃取頭在氣相色譜儀的進(jìn)樣口經(jīng)250℃老化0.5h備用；稱取樣品1.000g置于15mL頂空瓶中，加入轉(zhuǎn)子，再加入5mL煮沸去離子水和0.500gNaCl，然后加入10μL癸酸乙酯(8.64mg/L)作為內(nèi)標(biāo)，以帶聚四氟乙烯墊片的蓋子密封，搖勻。放在磁力加熱攪拌器(頂空加熱平臺(tái))上，加熱板溫度60℃，轉(zhuǎn)速600r/min，將固相微萃取頭插入頂空瓶頂空部位，平衡10min后推出纖維頭，纖維頭離液面約1cm，調(diào)整萃取時(shí)間和萃取溫度。萃取完成后收回纖維頭，立即插入氣相色譜(GC)進(jìn)樣口，于230℃下解析5min。所有樣品重復(fù)3次。

1.2.3 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，載氣為氦氣(純度＞99.999％)，進(jìn)樣口溫度250℃，柱流量1mL/min，脈沖不分流：起始溫度40℃保持3min，以3℃/min升到80℃，以2℃/min升到90℃，以3℃/min升到150℃，以5℃/min升到180℃，15℃/min升到230℃，保持2min，溶劑延遲3min。

MS條件：離子源EI，離子源溫度230cC：接口溫度250℃：EI源能量70eV：電子倍增器電壓1104V；質(zhì)量掃描范同(m/z)35～400；定量采用選擇離子掃描，每個(gè)物質(zhì)選擇一個(gè)定量離子，兩個(gè)定性離子。

1.2.4 空白基質(zhì)的制備

參照Du等的方法，稱取QC樣品50g于1L網(wǎng)底燒瓶，加水300mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低溫下(40～50℃)不斷補(bǔ)水旋蒸，定時(shí)取樣檢測(cè)，直至檢測(cè)不到揮發(fā)性成分(信噪比＜3)，冷凍干燥后作為空白基質(zhì)。

1.2.5 定性足量方法

1)定性方法

由GC-MS分析得到各色譜峰的質(zhì)譜信息與NISTl7標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)，匹配指數(shù)大于80％作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)保留指數(shù)計(jì)算公式，結(jié)合保留時(shí)間求出各待測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)(RI)，并通過文獻(xiàn)以及數(shù)據(jù)庫(kù)的保留指數(shù)進(jìn)行鑒定：將待測(cè)物質(zhì)的特征離子以及RI與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性。

2)定量方法

定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用空白基質(zhì)配制5個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。34種揮發(fā)性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值為0.9901～0.9999，說明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以很好地對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。將混標(biāo)溶液用無水乙醇稀釋為一系列質(zhì)量濃度溶液，吸取不同質(zhì)量濃度混標(biāo)溶液20μL到裝有空白基質(zhì)的頂空瓶中，同時(shí)加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行萃取，然后經(jīng)GC-MS分析測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過目標(biāo)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值即可算出目標(biāo)峰質(zhì)量濃度。具有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量：對(duì)于不具有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，采用官能團(tuán)相同、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行估算。

1.2.6 0AV計(jì)算

0AV為某香氣成分的質(zhì)量濃度與其嗅覺閾值的比值，按下式計(jì)算：

式中：C為香氣成分的質(zhì)量濃度，μg/L；0T為該香氣成分的閾值，μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20數(shù)據(jù)處理軟件(IBM)進(jìn)行方差分析(Analvsisofvariance，ANOVA)：采用SIMCA-P14.1軟件進(jìn)行主成分分析(Principalcomponentanalvsis，PCA)、層序聚類分析(Hierarchicalclusteranalvsis，HCA)和偏最小二乘判別分析(Partialleastsquares-discriminationanalvsis，PLS-DA)；P＜0.05為差異顯著。

相關(guān)鏈接：β-環(huán)檸檬醛，水楊酸甲酯，癸酸乙酯，α-紫羅酮

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