海灣扇貝(Argopectenirradians)是一種重要的經濟類海洋貝類。海灣扇貝柱富含多種營養(yǎng)成分，蛋白質、脂肪、糖類質量分數分別占14.03％，1.20％和3.07％，其中的總糖質量分數顯著高于巖扇貝(1.9％)、蝦夷扇貝(1.79％)及櫛孔扇貝(0.45％，極具開發(fā)價值。據報道，扇貝多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和抗凝血等活性，已經成為重要的功能食品資源。

由于扇貝不易貯藏，干制成為扇貝儲藏的主要手段。由于多糖與蛋白質相連，而海洋貝類普遍具有高蛋白質的特性，熱加工干制過程會加速兩者的結合，提取的多糖成分通常會含有蛋白質雜質。為減輕蛋白質對多糖結構和生物活性研究的干擾，脫蛋白質具有重要的意義。目前較普遍的蛋白質脫除方法如：TCA法、Seveage法、酶法等，其中，Seveage法不適合食品加工行業(yè)?，F階段對于扇貝多糖脫蛋白質的研究多集中于多糖得率和蛋白脫除率上，如李雪梅等，乙醇沉淀法結合TCA法脫除海灣扇貝多糖的蛋白質，脫除率達90％以上；劉禹等的研究表明，一種新興的D-葡萄糖酸-6-內酯(GDL)蛋白質脫除法，對蝦夷扇貝多糖的蛋白質脫除率可達99％，效果優(yōu)于TCA法。

蛋白質脫除方法在不同程度上都會影響到多糖的含量、得率或者活性，目前，關于蛋白質脫除方式對多糖結構、活性的影響鮮有報道。作者對干貝多糖進行不同方式的脫蛋白質處理，并比較了蛋白質脫除方式對干貝多糖結構和抗氧化活性的影響，以期找山干貝多糖的最佳脫蛋白質方法，為研究干燥過程對干貝多糖的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為海灣鮮扇貝，由大連玉洋集團有限公司提供，鮮貝柱于50℃下烘干，自制為干貝柱，粉碎備用。術瓜蛋白酶(1×10⁵u/g)、堿性蛋白酶(2×10⁵u/g)：上海瑞永生物科技有限公司產品：氫氧化鈉(分析純)：沈陽市聯邦試劑廠產品；三氯乙酸(TCA)：天津市科密歐化學試劑有限公司產品；濃硫酸(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司產品；D-葡萄糖酸-δ-內酯(GDL)：阿拉丁試劑(上海)有限公司產品；過氧化氫(分析純)、水楊酸(分析純)：北京化學試劑有限公司生產產品；FeSO₄·7H₂0(分析純)：天津市大茂化學試劑廠產品；苯酚、無水乙醇(分析純)：新光化工試劑廠產品；二苯基苦味肼基自由基(DPPH)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產品。

1.2 儀器與設備

PAL-1便攜式折光儀：日本ATAGO公司產品：XH-C漩渦混勻儀：常州越新儀器制造有限公司產品：SYNERGYHI酶標儀：美國伯騰儀器有限公司產品：UDKl52全自動凱氏定氮儀：意大利VELP公司產品：DY-200-BZ空氣浴振蕩搖床：廈門德儀設備有限公司產品：高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司產品：L-8900型氨基酸自動分析儀：日本HITACHI公司產品：G121M湘儀離心機：上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠產品：FD-1型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產品；Lambda25紫外-可見分光光度計：美國PerkinElmer公司產品：Sigma300掃描電子顯微鏡：卡爾蔡司(上海)管理有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 干貝粗多糖的提取

精確稱取適量干貝柱粉，以液料體積質量比為40mL:1g加入去離子水，在80℃下熱水浸提4h后超聲9min。過濾濾渣，調整浸提液固形物質量分數至10％，添加質量分數2％的木瓜蛋白酶進行酶解，酶解時問3h、溫度57.8℃、pH7.1。離心取上清液，加入體積分數95％乙醇至乙醇最終體積分數為75％，4℃靜置12h后，離心取沉淀，揮醇后凍干，得干貝粗多糖(DAMP)。將DAMP配制成質量濃度為50mg/mL的粗多糖溶液備用。

1.3.2 堿酶法蛋白質脫除

參照韓瑩等的方法并略做改進。將粗多糖溶液pH值調至10，加入堿性蛋白酶使酶質量分數為2％，于50℃酶解3h，沸水浴10min滅酶，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.3 稀堿法蛋白質脫除

參照陳利華等的方法并略做改進。60℃下用0.1moL的NaOH溶液提取3h，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.4 FCA法蛋白質脫除

參照李雪梅等的方法并略做改進。將質量分數2％的TCA溶液與一定體積的粗多糖溶液等體積混合，震蕩反應3h，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.5 GDL法蛋白質脫除

參照劉踽等的方法并略做改進。向粗多糖溶液中加質量分數2％的GDL溶液，使GDL的終質量分數達到0.3％～0.5％。置于45℃的恒溫水浴鍋中反應3h，4000r/min離心10min，收集上清液，醇沉后冷凍干燥。

1.3.6 蛋白質脫除率及多糖損失率的計算

采用苯酚-硫酸法測定多糖，采用凱氏定氮法舊測定蛋白質質量分數，測定3組平行取平均值。蛋白質脫除率及多糖損失率的計算公式如下：

式中：X₀為脫蛋白質前樣品中蛋白質量分數；X₁為脫蛋白質后樣品中蛋白質量分數。

式中：m₀為脫蛋白質前樣品提取物質量；m₁為脫蛋白質后樣品提取物質量。

1.3.7 單糖組成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定脫蛋白質純化后多糖的單糖組成，具體操作參考文獻。

1.3.8 氨基酸組成分析

使用氨基酸自動分析儀測定氨基酸種類與含量，氨基酸質量分數以mg/g表示。具體操作參考文獻。

1.3.9 剛果紅試驗

參照陳楊揚等的方法并略做改進。稱取多糖樣品各1mg，加入1mL蒸餾水和80μmol/L剛果紅溶液2mL，充分混勻后加入NaOH，使各組NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，并用紫外全波段掃描，記錄不同NaOH濃度下的最大吸收波長。

1.3.10 掃描電鏡分析

參照Wang等的方法并略做改進。取適量經蛋白脫除的多糖樣品，鍍上導電金粉后將其放置于掃描電鏡下觀察。工作條件：加速電壓15kV，觀測倍數分別選用200、1000、10000倍。

1.3.11 DPPH自由基清除能力的測定

參照Odeleye等的方法并略做改進。將待測樣品配制為30mg/mL的樣液，用無水甲醇依次稀釋成2、4、6、8、10mg/mL梯度。將2mL樣液與2mL0.16mmol/LDPPH-甲醇溶液(6.3lmg/dL)混合均勻。以VC作陽性對照，室溫下避光靜置30min后于517nm下用酶標儀測定吸光值。每個濃度梯度進行3組平行試驗。DPPH清除率計算方式為：

式中：A₀為無水甲醇代替樣品的測得吸光度值；A₁為樣品溶液的測得吸光度值；A₂為無水甲醇代替DPPH測得的吸光度值。

1.3.12 羥基自由基清除能力的測定

參照Liu等的方法并略做改進。將待測樣品配制為30mg/mL的原液，依次稀釋成2、4、6、8、10mg/mL的溶液。將1mL樣液與1mL9mmol/LFeS04溶液、1mL9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1mL8.8mmol/L的H₂0₂溶液混合均勻，37℃水浴30min，以VC作陽性對照于510nm下測吸光值，清除率按下式計算：

式中：A₃為去離子水代替樣品的測得吸光度值；A₄為樣品溶液的測得吸光度值；A₅為去離子水代替H₂0₂溶液測得的吸光度值。

1.3.13 數據處理

實驗結果以(平均值±標準偏差)表示，實驗數據采用SPSSStatistics17.0軟件進行單因素ANOVA分析，顯著性水平設定為0.05。

相關鏈接：水楊酸，過氧化氫，木瓜蛋白酶，二苯基苦味肼基自由基(DPPH)

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