2.2.2 響應(yīng)面分析及反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化

化根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)值鯊肝醇純度與3個因素的等高線及響應(yīng)面圖，見圖4～6。

通過對上述試驗結(jié)果的分析，確定回歸模型預(yù)測的最佳反應(yīng)參數(shù)為：V_二氯甲烷：V_無水甲醇=9.17:0.83，上樣量3.11g，洗脫流速1.93mL/min，預(yù)測結(jié)果為18.08％。

2.2.3 驗證檢驗

為驗證模型的準(zhǔn)確性，在以上最優(yōu)條件下做3次平行試驗，結(jié)果見表4。試驗組平均值與預(yù)測值相對誤差小于1％,說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 鯊肝醇制品組成分析

2.3.1 TLC結(jié)果

別對鯊肝醇與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品、鯊魚肝油富集前、后樣品進行點板顯色分析，結(jié)果如7所示。中性氧化鋁層析柱分離、純化鯊肝醇效果明顯，能將鯊魚肝油中鯊肝醇與角鯊烯分離。

2.3.2 組成成分分析

目前，市售的天然鯊肝醇產(chǎn)品主要指富含鯊肝醇的鯊魚肝油，一般純度在20％左右。本研究對影響中性氧化鋁層析柱分離、純化鯊肝醇作用效果的主要因素，即洗脫液比例、上樣量及洗脫流速進行優(yōu)化，得到最優(yōu)參數(shù)條件，使鯊肝醇純度達18.23％，此結(jié)果與市售鯊肝醇產(chǎn)品純度相差不大。圖8為鯊肝醇富集前、后的氣相色譜圖。鯊魚肝油不皂化物氣相檢測結(jié)果如圖8a所示，不皂化物中主要含有鯊肝醇與角鯊烯2種活性物質(zhì)，根據(jù)面積歸一法計算可得鯊肝醇含量為9.42％，角鯊烯含量為69.14％。

在洗脫液比例(V_二氯甲烷：V_無水甲醇)為9:1，上樣量3g及洗脫流速為2mL/min條件下，鯊肝醇經(jīng)中性氧化鋁層析柱分離純化后的氣相色譜分析結(jié)果如圖8所示，鯊肝醇含量有顯著提升。僅從譜圖看，鯊肝醇與角鯊烯含量的差距在縮短，鯊肝醇占18.23％，而角鯊烯占60.32％。試驗結(jié)果說明中性氧化鋁柱層析技術(shù)能有效分離純化鯊魚肝油中的鯊肝醇。

角鯊烯是由6個異戊二烯連接而成的高度不飽和的直鏈三萜類化合物，常溫下為淡黃色或無色油狀液體,具有提高缺氧耐受力功能，抑制微生物生長，抗菌消炎，調(diào)節(jié)膽固醇代謝等生物活性功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)中。角鯊烯來源廣泛，存在于微生物、植物種籽、微藻、鯊魚肝臟及人體皮脂中。然而，因植物及其加工副產(chǎn)物中角鯊烯含量過低而無法滿足實際工業(yè)生產(chǎn)所需，鯊魚肝油仍是生產(chǎn)高純度角鯊烯的主要原料。鯊魚肝油主要含有角鯊烯、烷基甘油及少量EPA、DHA、維生素A及維生素E等多種人體所需的營養(yǎng)素，是高品質(zhì)魚肝油之一。為了定量分析富集前、后鯊魚肝油中角鯊烯含量的變化，繪制角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。本研究中角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相分析結(jié)果如圖9a所示，由于在測定角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品時未衍生化處理，故角鯊烯的出峰時間約在15.017min，比圖8中的出峰時間提前了2.7min左右。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9b所示，橫坐標(biāo)為角鯊烯質(zhì)量濃度(μg/mL)，縱坐標(biāo)為峰面積，線性回歸方程為

y=1.921x+6.089，R²=0.9999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可得，富集前角鯊烯純度為54.21％，而富集后角鯊烯純度為49.18％。分析其原因可能是：中性氧化鋁層析柱對角鯊烯的吸附效果較強，而洗脫液未及時有效地將角鯊烯洗脫。一般地，常用硅膠柱分離、純化角鯊烯，選擇正己烷與乙酸乙酯復(fù)配作為洗脫液。

綜上所述，中性氧化鋁柱層析能有效分離純化鯊肝醇.并對鯊魚肝油不皂化物中的角鯊烯有篩選作用。在今后的研究中可用已脫除角鯊烯的不皂化物為原料進行鯊肝醇制品的富集純化。

2.3.3 方法學(xué)驗證

為了驗證GC儀器的穩(wěn)定性，在鯊魚肝油不皂化物中添加角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)液進行精密度及回收率的試驗。本研究選取10，100，400μg/mL與800μg/mL進行試驗。在相同條件下連續(xù)平行測試3d，每個質(zhì)量濃度平行測定5次，計算日間精密度和日內(nèi)精密度。由表5可知，在日問精密度與日內(nèi)精密度檢測中回收率在98.71％～101.98％，RSD在2.76～8.65，結(jié)果表明該儀器有較高的穩(wěn)定性與精密度。

3 結(jié)論

采用粒徑100～200目的中性氧化鋁為填料，研究其柱層析制備鯊肝醇制品的方法。采用TLC對樣品進行定性分析，GC對樣品進行定量分析并驗證儀器穩(wěn)定性與精密度。采用響應(yīng)面法優(yōu)化中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇工藝參數(shù)，得到最佳反應(yīng)參數(shù)為：洗脫液比例(V_二氯甲烷：V_無水甲醇)9:1，上樣量3g，洗脫流速2mL/min，所得鯊肝醇制品純度達18.23％。對鯊肝醇富集前、后的組成成分分析可知，中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇的同時，會對不皂化物中角鯊烯的含量造成損失。角鯊烯純度由54.21％減至49.18％。本文尚未有效分離鯊魚肝油不皂化物中的鯊肝醇與角鯊烯，今后將繼續(xù)開展鯊肝醇分離純化技術(shù)及功能活性等研究。

相關(guān)鏈接：氧化鋁柱，角鯊烯，維生素E

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食品學(xué)報》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系