2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌最小抑菌濃度的影響

在確定肉桂醇對(duì)副溶血性弧菌有抑菌活性基礎(chǔ)之上，采用二倍稀釋法測(cè)定3組副溶血性弧菌(包括UG、OMDG、CWDG)的MIC，結(jié)果見(jiàn)表1，細(xì)胞壁缺失可以改變副溶血性弧菌對(duì)抑菌劑的敏感性。肉桂醇對(duì)UG、OMDG和CWDG的MIC分別為原液質(zhì)量濃度的1/32、1/256和1/256。由該結(jié)果可知，丟失外膜層使菌體對(duì)肉桂醇的敏感程度增加，而進(jìn)一步丟失肽聚糖層未改變菌體對(duì)肉桂醇的敏感程度，說(shuō)明外膜是肉桂醇抑制副溶血性弧菌的主要作用位點(diǎn)。彭志峰等曾對(duì)比土霉素和四環(huán)素對(duì)鴨源雞桿菌親本株RU和外膜孔蛋白OmpW突變株△Omp形的MIC，結(jié)果顯示，△0mp形的MIC值分別降低到RU的1/8和1/32，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。以上結(jié)果說(shuō)明，外膜孔蛋白是外膜層中抑菌劑作用的靶點(diǎn)。

2.2 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

核酸和蛋白質(zhì)均是菌體重要的單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收波長(zhǎng)處菌液吸光度值增大時(shí)，說(shuō)明二者發(fā)生了外滲，表明細(xì)胞膜完整性遭受破壞。從表2中可以看出，通過(guò)不同質(zhì)量濃度的肉桂醇處理后，3組副溶血性弧菌的細(xì)胞膜均受到不同程度的破壞，并且隨著肉桂醇質(zhì)量濃度的增加，受到的破壞也越大，說(shuō)明肉桂醇會(huì)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜。當(dāng)肉桂醇質(zhì)量濃度低至1/4MIC時(shí)。對(duì)3組副溶血性弧菌的抑制作用已經(jīng)減弱，與空白組的細(xì)胞膜受損程度相近。相較于UG，OMDG和CWDG菌液中特征性吸光度值無(wú)顯著差異(P＜0.05)，表明進(jìn)一步的去除肽聚糖層對(duì)細(xì)胞膜的完整性無(wú)影響，即細(xì)胞壁中外膜層是菌體抵抗抑菌劑的主要結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞膜的損傷有保護(hù)作用。

2.3 內(nèi)膜通透性對(duì)肉桂醇抑菌性能的影響

硫酸粘桿菌素是一種窄譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抑菌作用。它先與外膜層中的脂多糖結(jié)合，破壞外膜通透性，進(jìn)而與細(xì)胞膜上脂蛋白結(jié)合，使細(xì)胞膜的通透性增加、表面張力降低，導(dǎo)致胞內(nèi)的重要物質(zhì)外滲，嚴(yán)重時(shí)引起菌體死亡例。由表3可知，在UG中，肉桂醇質(zhì)量濃度越低，菌體受到的破壞越小，內(nèi)容物滲出越少，0D值就越小；在0MDG和CWDG中,由于外膜層已被去除，細(xì)胞膜被硫酸粘桿菌素破壞，導(dǎo)致加入的肉桂醇已經(jīng)沒(méi)有可以作用的部位，因此肉桂醇質(zhì)量濃度的變化對(duì)結(jié)果無(wú)影響，故肉桂醇可能對(duì)外膜和細(xì)胞膜都有作用。

2.4 外膜蛋白SDS-PAGE

將從試驗(yàn)菌株副溶血性弧菌ATCCl7802中提取的外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。共獲得10條蛋白條帶，其分子質(zhì)量大小在18.4～66.2ku之間。與之前文獻(xiàn)報(bào)道的副溶血性弧菌外膜蛋白分子量范圍相符。

2.5 外膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)主要是用來(lái)判斷肉桂醇的作用位點(diǎn)是否為外膜層中的外膜蛋白。由圖1計(jì)算m提取的外膜蛋白樣品的質(zhì)量濃度為512μg/mL，滿(mǎn)足競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中對(duì)外膜蛋白的濃度要求。將副溶血性弧菌的外膜蛋白與1/2MIC肉桂醇互混1h后再與菌體細(xì)胞共培養(yǎng).外膜蛋白以劑量依賴(lài)方式減小肉桂醇對(duì)菌體細(xì)胞的損傷作用(圖3)，這說(shuō)明肉桂醇能與外膜蛋白產(chǎn)生相互作用，故菌體無(wú)法被PI染色，凋亡圖中總凋亡率隨外膜蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低。

2.6 細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌藥物敏感性的影響

細(xì)胞壁缺失對(duì)副溶血性弧菌藥物敏感性的影響見(jiàn)表4?？股卦谝志^(guò)程中作用的靶點(diǎn)不盡相同，四環(huán)素和紅霉素能抑制蛋白質(zhì)的合成，萬(wàn)古霉素能抑制細(xì)胞壁的合成，環(huán)丙沙星能抑制DNA的合成和復(fù)制，利福平能抑制RNA的合成。所測(cè)抗生素對(duì)UG均有效，作用于細(xì)胞壁的萬(wàn)古霉素對(duì)0MDG和CWDG無(wú)效，說(shuō)明處理的菌體缺失了其作用靶點(diǎn)。然而，利福平在接觸0MDG細(xì)胞時(shí)藥效下降，這可能是因?yàn)橥饽び绕涫峭饽さ鞍资抢Ｆ竭M(jìn)入菌體的通道，而在接觸CWDG細(xì)胞時(shí)藥效丟失，可能肽聚糖層也在該藥進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中起到一定作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《中國(guó)食品學(xué)報(bào)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：萬(wàn)古霉素，肉桂醇，革蘭氏陰性菌，硫酸粘桿菌素