目的研制一種能夠用于快速鑒定單核細(xì)胞增生李斯特菌(以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌)的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。方法設(shè)計(jì)一種質(zhì)粒DNA包含目前常用于單增李斯特菌檢測(cè)的hlyA、plcB、inlA基因，并對(duì)其穩(wěn)定性、均勻性和量值可追溯性進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)估其在實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)中的適用性。結(jié)果質(zhì)粒DNA參考物質(zhì)的最終定值結(jié)果為29.85μg/mL。該質(zhì)粒DNA參考物質(zhì)量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好，可以在-20℃下保存1年以上。質(zhì)粒DNA參考品在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中的適用性證明，可以保證實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果與單增李斯特菌基因組DNA參考品具有可比性。結(jié)論研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以替代單增李斯特菌基因組DNA對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，滿足單增李斯特菌檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的有效控制和試驗(yàn)方法驗(yàn)證的需要。

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌),歸屬于李斯特菌屬(Listeria),在世界范圍內(nèi)被公認(rèn)是一種重要的人獸共患食源性致病菌，該菌具有較強(qiáng)的致病性，可導(dǎo)致單核細(xì)胞增多、敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)及死胎等。單增李斯特菌易通過(guò)肉乳制品引起人的感染發(fā)病，因此世界多國(guó)衛(wèi)生部門已經(jīng)逐步重視起對(duì)單增李斯特菌的防控。

目前單增李斯特菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)已經(jīng)從微生物學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)向核酸檢測(cè)。PCR方法原理是利用單增李斯特菌區(qū)別于李斯特菌屬內(nèi)其他細(xì)菌的多個(gè)靶基因選擇特異性序列建立PCR以及實(shí)時(shí)熒光PCR。單增李斯特菌毒力基因主要集中在兩個(gè)毒力島IPI-1和LIP-2,其中李氏溶血素基因(hlyA)、磷脂酶C基因(plcB)屬于LIP-l,內(nèi)化素基因(inlA)屬于LIP-2。hlyA基因編碼的李斯特菌溶血素O(1isteriolysin,LLO)是單增李斯特菌最重要的一種毒力因子，是單增李斯特菌檢測(cè)的關(guān)鍵性靶標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)三種毒力基因?qū)⒂兄诹私饫钏固鼐亩玖顩r，并進(jìn)行相關(guān)分型。

但是作為PCR檢測(cè)方法相應(yīng)的核酸參考品目前十分缺乏?；蚪MDNA作為參考品，難以同時(shí)為多個(gè)靶標(biāo)提供可溯源的定量參考。小片段核酸則無(wú)法在多種檢測(cè)試劑和方法之間提供可參比的參考性。因此新型的可對(duì)多種檢測(cè)靶標(biāo)量值溯源的核酸參考材料對(duì)于李斯特菌的核酸檢測(cè)發(fā)展至關(guān)重要。

本研究中，擬通過(guò)合成含有單增李斯特菌檢測(cè)的hlyA、plcB、inlA基因的質(zhì)粒作為熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)參考品，并就其均勻性、穩(wěn)定性等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討其替代傳統(tǒng)基因組參考品的可行性，以期這種可追溯的、有效的參考材料可以解決病原核酸檢測(cè)能力快速發(fā)展與缺乏參考材料之間的矛盾。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19115),由廣州海關(guān)檢驗(yàn)檢疫中心保存。全基因人工合成等服務(wù)由上海吉瑪生物工程有限公司提供；引物合成、DNA測(cè)序由華大基因科技股份有限公司提供。ABI SYBR FAST qPCR Master Mix(2×)(英國(guó)New England Biolabs)。

1.2方法

1.2.1片段設(shè)計(jì)和克隆

根據(jù)單增李斯特菌檢測(cè)的hlyA(GenBank:KC770796.1)、plcB(GenBank:JF712529.1)、inlA(GenBank:EF445938.1)基因序列人工合成一段基因作為檢測(cè)靶標(biāo)片段。單個(gè)基因的核酸序列可在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心。將三個(gè)基因以1∶1的比例串聯(lián)在一起(以不相關(guān)的基因片段aagtcg隔開(kāi)),并克隆到pUC57中以形成重組質(zhì)粒，命名為pDNA Listeria,擴(kuò)增純化后用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.2質(zhì)粒純度鑒定

采用紫外分光光度(UV)法對(duì)質(zhì)粒DNA的純度進(jìn)行鑒定，通過(guò)檢測(cè)樣品在260、280、230 nm波段的紫外光下的吸光度值(A260,A280,A230),確定樣品純度，排除RNA和蛋白質(zhì)污染。質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之間，A260/A230大于2.0被認(rèn)為純度符合參考品要求。

1.2.3均勻性檢測(cè)

依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization,ISO)規(guī)定的方法進(jìn)行取樣，最小采樣量為1μL,使用UV法分析pDNA的瓶間性和瓶?jī)?nèi)均勻性。

瓶?jī)?nèi)均勻性檢測(cè)：隨機(jī)選擇9管pDNA,從每管樣品的上層、中層和下層分別提取1μL測(cè)試用樣品，UV法檢測(cè)后方差分析(F-測(cè)試)瓶?jī)?nèi)均勻性。

瓶間均勻性檢測(cè)：隨機(jī)選擇10管pDNA,并用UV法對(duì)每管中提取的1μL樣品重復(fù)測(cè)量3次，方差分析瓶間均勻性。并根據(jù)ISO指南35評(píng)估pDNA均勻性的不確定性貢獻(xiàn)。根據(jù)公式(1)計(jì)算質(zhì)粒DNA的瓶間不均勻性引起的不確定度(uh):所有公式中變量均改為斜體

其中：Q1為組間差方和，Q2為組內(nèi)差方和，v1為組間自由度，v2為組內(nèi)自由度，n為組內(nèi)測(cè)量次數(shù)。

1.2.4穩(wěn)定性檢測(cè)

在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備中需要考慮物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性。分別選擇4、-20、-70℃UV法進(jìn)行短期穩(wěn)定性(6個(gè)月)試驗(yàn)，56℃(2個(gè)月)進(jìn)行極端溫度試驗(yàn)，溫度-20℃作為制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特定儲(chǔ)存條件進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)(每月UV法檢測(cè)一次，一共檢測(cè)12個(gè)月)。監(jiān)測(cè)質(zhì)粒pDNA Listeria在儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。并根據(jù)ISO指南35評(píng)估長(zhǎng)時(shí)間保存的穩(wěn)定性，并評(píng)估穩(wěn)定性的不確定性貢獻(xiàn)。進(jìn)一步根據(jù)公式(2)計(jì)算質(zhì)粒DNA在12個(gè)月內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性引起的不確定度(us):

其中：β1是穩(wěn)定性線性模型中的斜率，S(β1)是斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，N是穩(wěn)定性評(píng)估的總時(shí)間，N=12個(gè)月。

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