2結(jié)果與分析

2.1近紅外免疫層析試紙條定性檢測

采用近紅外熒光染料標(biāo)記的雙抗體夾心免疫層析試紙條檢測單增李斯特氏菌。免疫層析反應(yīng)結(jié)束后，以近紅外熒光掃描儀測定檢測線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度。在抗體墊上固定有近紅外熒光標(biāo)記的單克隆抗體和作為質(zhì)控物的近紅外熒光標(biāo)記的IgG多克隆抗體。當(dāng)含有單增李斯特菌的樣品滴加到試紙條樣品墊上后，靶標(biāo)致病菌與抗體墊上的標(biāo)記抗體結(jié)合，形成熒光標(biāo)記物-標(biāo)記抗體-靶標(biāo)分子復(fù)合物。

復(fù)合物隨溶液向試紙條前端遷移，當(dāng)復(fù)合物遷移至檢測線時，被固定于檢測線上的抗致病菌抗原的另一株單克隆抗體所捕獲。熒光標(biāo)記的IgG多克隆抗體隨溶液繼續(xù)遷移，到達(dá)質(zhì)控線時被固定于質(zhì)控線上的山羊抗IgG多克隆抗體所捕獲。檢測中所使用的近紅外熒光染料為發(fā)射波長位于775nm±5nm，激發(fā)波長為795nm±5nm的有機(jī)分子。若試紙條質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；以同時出現(xiàn)檢測線區(qū)域和質(zhì)控線區(qū)域熒光峰為陽性結(jié)果，反之則為陰性。

如圖2所示，根據(jù)該樣品的定性檢測結(jié)果，質(zhì)控線區(qū)域峰值達(dá)到3800，檢測線峰值達(dá)到2000左右；在質(zhì)控線區(qū)域、檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，反應(yīng)為陽性結(jié)果，說明該樣品中含有單增李斯特氏菌，表明該熒光標(biāo)記的單增李斯特氏菌試紙條可以使用，具有有效性。

2.2近紅外免疫層析試紙條定量檢測

按照1.3.5實驗步驟，將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入試紙條待檢，采用近紅外熒光掃描儀進(jìn)行掃描。若檢測線區(qū)域、質(zhì)控線區(qū)域均出現(xiàn)熒光峰表明檢測結(jié)果為陽性。

以檢測熒光峰值相應(yīng)的樣品濃度對數(shù)值作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖3)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出計算公式為Y=1.2452X+2.4362，r2=0.9722(X熒光檢測值，Y是標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值lg值)。

結(jié)果顯示，單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.5×103CFU/mL至1.5×105CFU/mL時，熒光比值與濃度線性關(guān)系良好，即線性范圍0.5×103～1.5×105CFU/mL。崔煥忠等采用膠體金免疫層析試紙條對自來水、生肉制品、蔬菜、冷凍蝦仁等模擬樣品的檢測限為3.9×105CFU/mL。2014年潘秀華等研制的單增李斯特菌膠體金試紙條的靈敏度為2.4×105CFU/mL。

2.3傳統(tǒng)方法檢測

通過對標(biāo)準(zhǔn)菌株的實驗結(jié)果觀察，按照GB4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》傳統(tǒng)檢測方法得到的結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，采用傳統(tǒng)檢測方法檢測結(jié)果為未增菌條件下，檢測限為1.5×104CFU/mL。與傳統(tǒng)檢測方法相比，基于近紅外熒光染料標(biāo)記的免疫層析體系對靶標(biāo)菌的靈敏度提高約30倍。

2.4近紅外免疫層析試紙條特異性實驗

利用近紅外免疫層析試紙條對副溶血弧菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌進(jìn)行檢測。實驗發(fā)現(xiàn)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌及副溶血弧菌檢測線區(qū)域(如圖5箭頭所指示位置)均未出現(xiàn)發(fā)射峰，僅質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)發(fā)射峰，如圖5所示。單增李斯特菌的檢測線區(qū)域與質(zhì)控線區(qū)域均出現(xiàn)發(fā)射峰，表明該近紅外快速檢測試紙條對單增李斯特氏菌的特異性好，與其他5個菌屬無交叉反應(yīng)。

2.5試紙條穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將制備好的試紙條置于4℃條件下，放置20d，采用近紅外熒光掃描儀進(jìn)行定性檢測，通過靈敏度和特異性判斷試紙條的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖所示6，將所研制的試紙條分別進(jìn)行初始檢測、20d后再次進(jìn)行檢測，同時出現(xiàn)檢測線區(qū)域和質(zhì)控線區(qū)域熒光峰為陽性結(jié)果。說明圖6前面3個檢測線區(qū)域、質(zhì)控線區(qū)域為初始檢測，后面3個檢測線、質(zhì)控線區(qū)域為20d后近紅外熒光檢測儀所測得結(jié)果。結(jié)果顯示該試紙條靈敏度沒有明顯下降，特異性良好，穩(wěn)定性較好。

2.6近紅外免疫層析試紙條樣本檢測

按照傳統(tǒng)檢測法和所建立的近紅外熒光法，對實驗室30份食品樣品進(jìn)行檢測，其中13份樣品為添加單增李斯特氏菌樣本。近紅外免疫層析試紙條法檢出陽性樣品15份；傳統(tǒng)檢測方法的檢出陽性樣品13份(如表1所示)。

按照公式，特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%

近紅外免疫層析試紙條特異性a=17/(17+2)×100%=89.47%；靈敏度b=13/(13+0)×100%=100%。將2種方法進(jìn)行符合性比較，近紅外免疫層析試紙條檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個樣品近紅外免疫層析檢測結(jié)果為陽性，與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果不一致。通過計算比較兩種方法的符合率=(30?2)/30×100%=93.3%。

3結(jié)論

本研究研制的適用于現(xiàn)場快速檢測的雙抗體近紅外熒光免疫層析試紙條，能在45min快速檢測到樣品中單增李斯特氏菌，靈敏度為0.5×103CFU/mL?？梢钥闯?，與常用的膠體金試紙條相比，本團(tuán)隊基于近紅外熒光染料標(biāo)記的免疫層析體系對靶標(biāo)菌的靈敏度提高約200倍以上，因此該檢測方法較其他方法信噪比高，靈敏度理想。本方法所涉的免疫層析試紙條及近紅外熒光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個檢測過程可在45min內(nèi)完成，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測。相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法5～6d的檢測周期及繁瑣的培養(yǎng)基配制等過程具有顯著的時效性優(yōu)勢；相對于PCR及實時熒光定量PCR法等分子生物學(xué)方法則在儀器的檢測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢。

在實際工作中，可以與經(jīng)典常規(guī)方法進(jìn)行互補(bǔ)，縮短檢測時間，適合現(xiàn)場快速檢測，在進(jìn)出口食品安全檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。2016年開始本團(tuán)隊陸續(xù)開發(fā)出近紅外熒光免疫層析試紙條檢測食源性致病菌，檢測對象包括沙門氏菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等。通過研究發(fā)現(xiàn)近紅外熒光免疫檢測法靈敏度較高。采用近紅外熒光免疫測定法，可以避免人為判讀的錯誤，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，容易保存，為現(xiàn)場提供快速、準(zhǔn)確的檢測方法。下一步工作我們計劃將食品樣品的處理方法進(jìn)行優(yōu)化，以提高試紙條靈敏度和特異性，并將對方法進(jìn)行完善，盡快研制出單增李斯特氏菌檢測試劑盒可為口岸提供一種可靠穩(wěn)定的快檢技術(shù)。

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