2.4法蘭克福香腸中單核細胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的檢測

在不同濃度英諾克李斯特菌存在的情況下，人工污染法蘭克福香腸浸出液經(jīng)增菌培養(yǎng)后，采用平板涂布法均能檢測到單核細胞增生李斯特菌。但隨著英諾克李斯特菌污染濃度的提高，單核細胞增生李斯特菌在第一步增菌中的終濃度顯著下降。當LM/LI=1∶1000時，即使經(jīng)FB和MOPSBLEB培養(yǎng)基二次增菌，單核細胞增生李斯特菌的終濃度也僅能達到103CFU/mL，其生長受到明顯的抑制。

采用IBMSPSSStatistics19統(tǒng)計軟件對不同磁珠捕獲前后獲得的菌落數(shù)進行配對Ｔ檢驗分析（表5）。人工污染樣品經(jīng)磁珠處理后，單核細胞增生李斯特菌與英諾克李斯特菌在顯色培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比例存在顯著性差異（P=0.023＜0.05），經(jīng)scFv-IMBs捕獲后顯色平板上的單增李斯特菌的菌落數(shù)比例顯著提高。經(jīng)UＶM和FB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，scFv-IMBs和Dyna-IMBs捕獲兩種李斯特菌的菌落數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P=0.886和P=0.340），而經(jīng)MOPS-BLEB培養(yǎng)后，scFv-IMBs的選擇性顯著高于Dyna-IMBs磁珠（P＜0.01）。

以配對Ｔ檢驗比較和分析不同LM/LI比例分別經(jīng)3種增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，單核細胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的回收情況見表6。對單核細胞增生李斯特菌的回收進行比較，scFv-IMBs與Dyna-IMBs的回收率相比有極顯著性差異（P＜0.01）。分別統(tǒng)計每一種培養(yǎng)基經(jīng)磁珠處理后的回收率，在UＶM和FB培養(yǎng)基中scFv-IMBs和Dyna-IMBs的回收率有極顯著性差異（P＜0.01），但在MOPS-BLEB培養(yǎng)基中兩種磁珠之間無顯著性差異（P=0.37＞0.05）。對英諾克李斯特菌的回收率進行比較，scFv-IMBs在每一種培養(yǎng)基中的回收率均顯著低于Dyna-IMBs（P＜0.01），scFv-IMBs顯示出較好的單核細胞增生李斯特菌特異性，可以在混合體系中顯著降低英諾克李斯特菌的干擾。

二次增菌培養(yǎng)后經(jīng)磁珠處理的培養(yǎng)物在顯色平板上劃線。結果顯示，經(jīng)scFv-IMBs處理后在FB（LM/LI=1/1000）培養(yǎng)基（LM/LI=1/100和1/1000）的增菌液中，未能獲得單核細胞增生李斯特菌的單菌落。而經(jīng)Dyna-IMBs處理后，LM/LI多數(shù)組合中FB和MOPS-BLEB培養(yǎng)基的培養(yǎng)物無法分離獲得目標微生物的單菌落，甚至無法檢測到單核細胞增生李斯特菌的典型菌落（表7）。scFv-IMBs的高特異性可以較容易的從高濃度英諾克李斯特菌培養(yǎng)體系中分離單核細胞增生李斯特菌。與之相對的，Dyna-IMBs對單核細胞增生李斯特菌的特異性低于scFv-IMBs，在顯色培養(yǎng)基上引入了更多的背景干擾菌，尤其是高濃度的英諾克李斯特菌。在LM/LI=1/1000時，僅能通過靈敏度更高的PCR方法檢測到目標菌的存在，在選擇性平板上也無法有效分離目標菌。采用PCR檢測可在除LM/LI=1/100和1/1000外的試驗組合中成功檢測到目標菌，考慮到免疫磁珠的捕獲效率在1.0%～20.0%之間，食品樣品中大量的英諾克李斯特菌將對單核細胞增生李斯特菌的檢測產(chǎn)生較大的影響。

3討論

一般情況下，法蘭克福香腸中單核細胞增生李斯特菌的分離率可達2%至8%，是極易引發(fā)李斯特菌食物中毒的一種即食食品。但因其組成復雜、基質(zhì)干擾大，給單核細胞增生李斯特菌的分離帶來很大影響。在自然環(huán)境中，單核細胞增生李斯特菌常與其它李斯特菌伴生，并易被掩蓋。尤其是英諾克李斯特菌的存在顯著影響平板分離的效果，即便LM/LI比例在1/1的情況下，仍有很大干擾。

在培養(yǎng)過程中，損傷修復功能被認為有助于提升目標菌的數(shù)量，但第2次增菌時間超過24h并不一定會顯著提升目標菌數(shù)量。經(jīng)增菌培養(yǎng)后，英諾克李斯特菌的生長速率一般會高于單核細胞增生李斯特菌，導致在選擇性瓊脂培養(yǎng)基上無法分離。因此，低濃度的單核細胞增生李斯特菌在食品中易被漏檢。借助免疫磁珠捕獲技術可在選擇性平板上更容易地發(fā)現(xiàn)目標菌，并獲得單菌落。但由于免疫磁珠中抗體制備困難、非特異性結合和低捕獲率導致該方法的應用受到限制。有研究顯示，Dyna-IMBs在單核細胞增生李斯特菌含量為103CFU/mL的體系中捕獲率不足10%，對其它李斯特屬細菌也有0.02%～3.42%的非特異性結合。在本研究中，scFv-IMBs對非單核細胞增生李斯特菌的結合率低于0.5%，具有較好的選擇特異性。

scFv抗體只有一條輕鏈和一條重鏈，與完整抗體相比scFv與抗原的結合力較弱，這可能是導致在增菌培養(yǎng)基中scFv-IMBs捕獲效率略低于Dyna-IMBs的原因。但scFv-IMBs可以在高濃度英諾克李斯特菌存在的食品基質(zhì)中有效分離單核細胞增生李斯特菌，其檢測靈敏度可達到1CFU/mL。在選擇性平板上經(jīng)scFv-IMBs捕獲處理培養(yǎng)物中單核細胞增生李斯特菌的菌落數(shù)比例和分離情況明顯優(yōu)于Dyna-IMBs。

據(jù)報道，UＶM和FB培養(yǎng)基會降低單核細胞增生李斯特菌表面抗原的表達，而MOPS-BLEB培養(yǎng)基中的BLEB成分可提高單核細胞增生李斯特菌表面抗體的表達。通過在不同培養(yǎng)基中比較免疫磁珠對目標菌的分離率，也表明MOPSBLEB培養(yǎng)基中磁珠捕獲效果明顯優(yōu)于UＶM和FB培養(yǎng)基。因此，選用免疫磁珠捕獲時，應充分考慮增菌培養(yǎng)基對磁珠捕獲效果的影響。

本研究制備了一種單核細胞增生李斯特菌特異性的單鏈抗體片段捕獲磁珠（scFv-IMBs），可從較高濃度背景微生物的法蘭克福香腸中，尤其是存在英諾克李斯特菌的情況下，有效地富集和分離單核細胞增生李斯特菌，與市售免疫磁珠產(chǎn)品相比具有更好的分離能力，可用于實際樣品的檢驗檢測。

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