朝鮮薊為菊科菜薊屬多年生草本植物，主要種植于地中海地區(qū)，起源于野生多年生的野生型刺菜薊，是一種富含營養(yǎng)物質(zhì)的保健蔬菜，被認(rèn)為是一種功能性食品，具有緩解肝膽疾病及消化不良、抗氧化、抗菌、抗癌等多種生理功能活性。朝鮮薊的可食部分為內(nèi)部苞片及花托，不可食用的工業(yè)副產(chǎn)物部分包括其外部苞片及莖葉，占整個(gè)植株鮮重的80％左右，造成大量的土地占用、資源浪費(fèi)及環(huán)境污染，因此對朝鮮薊莖葉副產(chǎn)物的開發(fā)利用尤為重要。

萜類化合物是異戊二烯聚合物及其衍生物的總稱，而倍半萜化合物及三萜化合物是朝鮮薊中主要的親脂類化合物。Ramos等從刺菜薊中提取了脂溶性成分并對其組分進(jìn)行系統(tǒng)分析，其中去酰基菜薊苦素、羽扇豆醇醋酸酯、ψ-蒲公英甾醇醋酸酯在栽培型刺菜薊中均為第1次報(bào)道。有文獻(xiàn)表明，萜類化合物具有抗高血脂圈、抗炎嘲、抗癌同等生理活性，然而截至目前，對朝鮮薊副產(chǎn)物中萜類化合物的開發(fā)利用及相關(guān)活性的研究較少，對于其神經(jīng)保護(hù)作用的報(bào)道更是不足。
大量研究表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，如阿爾茲海默癥和帕金森病等。在神經(jīng)退行性疾病中，活性氧引起的氧化應(yīng)激被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要原因之一?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化的有效治療方法是保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷。有大量研究證明，許多天然抗氧化物都具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究采用GC-MS分析朝鮮薊副產(chǎn)物脂溶性提取物中萜類及甾醇類化合物的組成與含量，通過測定不同指標(biāo)研究脂溶性提取物對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為朝鮮薊副產(chǎn)物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝鮮薊的莖葉等副產(chǎn)物于2018年4月份采自于中國云南省曲靖市陸良縣中樞鎮(zhèn)華僑農(nóng)場，采收后當(dāng)天立即空運(yùn)送往實(shí)驗(yàn)室，液氮冷凍干燥、粉碎，過50目篩，裝于自封袋中，于-20℃冰箱中保存。

正構(gòu)烷烴(C7～C40)，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；正十六烷(純度>99.5％)、吡啶(純度>99.9％)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；菜薊苦素(純度96.4％)、豆甾醇(純度98％)、β-谷甾醇(純度95％)、羽扇豆醇(純度98％)，天津阿爾塔科技有限公司；α-香樹脂醇(純度≥98％)、β-香樹脂醇(純度≥98％)、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒，美國Sigma-A1drich公司；三甲基氯硅烷(純度>99％)、N，0-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(純度96％)、二氯甲烷(分析純級)，上海麥克林生化科技有限公司；30％H202溶液，國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；RPMll640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、0.25％胰蛋白酶，美國GIBCO公司；胎牛血清，美國HYCLONE公司；二甲基亞砜(DMSO)、PBS緩沖液、DPBS緩沖液、CCK8試劑盒、DCFH-DA試劑盒、吖啶橙-溴化乙錠(A0-EB)試劑盒，索萊寶生物科技有限公司；脂質(zhì)氧化(MDA)試劑盒、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

6890N/5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技公司：BDFACSEALIBUR型流式細(xì)胞儀，美國BD公司：YG-XD30型熒光顯微鏡，中國PVD公司；Tis型倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司：InfiniteF50型酶標(biāo)儀。澳大利亞TECAN公司。

1.3 脂溶性物質(zhì)的提取

參考Romas等的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取朝鮮薊副產(chǎn)物凍干粉5g，加入125mL二氯甲烷，索氏提取7h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下對提取液進(jìn)行低壓干燥，旋蒸后加入二氯甲烷對干燥后的提取物進(jìn)行復(fù)溶，定容至25mL，取1mL氮吹至徹底干燥，于-20℃冰箱中保存。

1.4 GC-MS分析

參考Romas等的方法并稍作修改。在進(jìn)行GC-MS檢測之前，先進(jìn)行三甲基硅烷化(TMS)衍生，向氮吹干燥后的脂溶性提取物中加入250μL含1mg正十六烷(內(nèi)標(biāo))的吡啶，待提取物完全溶解后，加入250μL的N，O-雙(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺和50μL的三甲基氯硅烷，混合物于70℃反應(yīng)30min。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配以DB-5J&W毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm，美國安捷倫科技公司)，載氣為高純氦氣(41cm/s)。色譜的操作條件為：自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣口溫度270℃，分流比30:1。柱溫箱的升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?20℃，保持2min，以4℃/min的速度升至250℃，而后以2℃/min的速度升至285℃，并保持15min。質(zhì)譜的操作條件為：離子碰撞模式，離子能量70eV，以全掃描模式進(jìn)行信息采集。掃描范圍為，以30～600，離子源溫度230℃。
GC-MS色譜圖的處理軟件采用MSDChem-Station工作站(Agilent，VersionE02)。定性時(shí)，通過將色譜峰的質(zhì)譜信息與相關(guān)文獻(xiàn)及工作站所匹配的NIST質(zhì)譜庫進(jìn)行比較，必要時(shí)通過標(biāo)樣定性。定量時(shí)，主要的萜類及甾醇類化合物通過標(biāo)曲定量。其余化合物通過內(nèi)標(biāo)(正十六烷)定量，結(jié)果均折算為樣品中物質(zhì)的含量，用mg/kgDM表示。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

參考Tang等的方法并稍作修改。將PCI2細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基，10％胎牛血清，1％青霉素-鏈霉素)接種于6孔板中，接種密度3×105個(gè)/mL。接種量2mL/孔，置于37℃，5％CO2的水套式CO2孵育箱中培養(yǎng)24h。

1.6 細(xì)胞活力的測定

將PCI2細(xì)胞用完全培養(yǎng)基接種于96孔板中，接種密度3×105個(gè)/mL，接種量100μL/孔，于37℃，5％C02的孵育箱中培養(yǎng)24h。用不完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基，2％胎牛血清，1％青霉素-鏈霉素)將脂溶性提取物稀釋至高、中、低3個(gè)不同的質(zhì)量濃度，分別處理PC12細(xì)胞8h后。加入含90μmol/LH202的不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。與預(yù)保護(hù)后傷害組相對應(yīng)，以未經(jīng)脂溶性提取物保護(hù)、經(jīng)H202傷害的PCI2細(xì)胞作為模型組，以未經(jīng)H2O2傷害、經(jīng)高濃度脂溶性提取物處理的PCI2細(xì)胞作為脂溶性提取物保護(hù)組。以未經(jīng)任何處理的PC12細(xì)胞作為空白對照組，利用CCK8法檢測每孔中細(xì)胞的存活率，參考Ding等圈的方法，將處理后的細(xì)胞移除培養(yǎng)基，加入100μL/孔配好的CCK8工作液，置于5％CO2的孵育箱中，37℃孵育2h。酶標(biāo)儀檢測橘黃色甲臌的生產(chǎn)量。檢測波長450nm處的吸光度值，每組做6個(gè)平行。

1.7 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測

細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH含量是衡量細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，對按照1.5節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行4組不同處理后，收集每孔中的培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基中LDH活性。

1.8 抗氧化活性的測定

氧化應(yīng)激會直接或間接導(dǎo)致ROS介導(dǎo)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷，并且涉及癌變圜、神經(jīng)退行性病變幽、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病圓和衰老陶等。在神經(jīng)退行性疾病中，活性氧(ROS)引起的氧化應(yīng)激被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要原因之一，本研究利用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。對按照1.5節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行脂溶性提取物處理組、模型組、空白對照組3組處理后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化細(xì)胞，于4℃，1500r/min離心3min后使用完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，按照1:1000比例用無血清培養(yǎng)基(RPMll640培養(yǎng)基，1％青霉素-鏈霉素)稀釋DCFH-DA。取0.5mL稀釋液加入細(xì)胞，于CO2孵育箱中避光孵育20min，使用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，并用流式細(xì)胞儀量化檢測。檢測條件為激發(fā)波長488nm。發(fā)射波長605nm。對按照1.5節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行4組處理后，按照試劑盒說明書對細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)水平進(jìn)行檢測，來確定脂質(zhì)氧化的水平。

1.9 細(xì)胞凋亡的測定

對按照1.5節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后傷害組、模型組、空白對照組3組處理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。杜氏磷酸緩沖液(DPBS)洗滌細(xì)胞2次，加入500μL去離子水稀釋好的結(jié)合緩沖液(1×)重懸細(xì)胞，上機(jī)前加入5μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)和10μL碘化丙啶(PI)，室溫避光反應(yīng)10min，細(xì)胞流式儀量化檢測，檢測條件為激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm。對按照1.5節(jié)方法培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后傷害組、模型組、空白對照組3組處理后，向每個(gè)細(xì)胞處理組的培養(yǎng)基中加入40μLA0-EB染液，室溫放置5min，熒光顯微鏡拍照觀察。

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