熱激轉錄因子在植物適應生物脅迫和非生物脅迫的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，賦予植物多種抗逆性。熱激轉錄因子家族成員序列大小不一，但結構域比較保守，主要包含N端高度保守的DNA結合結構域，它可識別并結合熱激元件從而激活熱激蛋白基因的轉錄；依次是寡聚化結構域，由2個疏水七肽重復區(qū)域組成，并通過一段可變長度的柔性序列連接到DBD。該結構域可促進與HSP啟動子中HSE的結合，調(diào)控HSP的轉錄；接著是核定位信號和核輸出信號，NLS是一簇堿性氨基酸區(qū)域，與進入細胞核有關。NLS和NES協(xié)同調(diào)控Hsfs在細胞核和細胞質中的分布；C端轉錄激活結構域含有短肽AHA基序，具有轉錄激活功能。根據(jù)Hsfs結構特點，將植物Hsfs分為3個主要亞家族。橡膠樹Hsfs家族共30個成員，也分為HsfsA、B和C。Hsfs能夠識別熱激元件HSE并與之結合，從而激活下游基因如HSP的轉錄，響應生物脅迫和非生物脅迫。小麥熱激轉錄因子TaHsfA6f調(diào)控一系列下游基因的轉錄，參與保護植物免受高溫損傷。枇杷EjHsf1通過調(diào)節(jié)下游基因EjHSP的轉錄響應低溫脅迫。擬南芥NPR1與HsfA1互作從而激活HsfA1參與低溫脅迫反應。DREB2A能夠調(diào)控HsfA3的表達進而響應鹽脅迫和干旱脅迫。HsfA4a亦能提高擬南芥的耐鹽性和耐氧化性。植物Hsfs家族成員較多，結構復雜，功能多樣，響應于多種逆境交叉脅迫，是一類理想的遺傳改良候選基因。

巴西橡膠樹是重要的熱帶經(jīng)濟作物，原產(chǎn)于亞馬遜河流域。目前，已大規(guī)模種植于南亞或東南亞以及赤道附近南北緯度10°之間的熱帶地區(qū)，該地區(qū)屬于傳統(tǒng)植膠區(qū)，無低溫侵襲，且雨水充足。我國的橡膠樹種植區(qū)位于熱帶北緣，屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，經(jīng)常遭遇寒潮侵襲，以及干旱危害。選育高產(chǎn)抗逆品種是保障我國天然橡膠高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有效途徑。但是，由于橡膠樹育種周期特別漫長，而且因缺乏高效的早期評選技術，高產(chǎn)性狀和耐寒性狀難于聚合，導致生產(chǎn)上的高產(chǎn)耐寒品種極度匱乏，嚴重影響我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了解決這一問題，可開發(fā)相應的分子標記輔助橡膠樹的新品種培育，以及通過轉基因技術提高高產(chǎn)橡膠樹品種的耐寒性，創(chuàng)制新品種。本文分析了30個橡膠樹Hsf家族成員在低溫脅迫下橡膠樹‘93-114’和‘熱墾501’樹葉中的表達模式，還鑒定了Hsf家族成員對干旱和高鹽脅迫的響應。研究結果為進一步解析Hsf家族成員的抗逆機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所橡膠樹種苗培育基地培育的橡膠樹無性系‘93-114’和‘熱墾501’袋裝苗，處于穩(wěn)定期一蓬葉幼苗。天根生化科技（北京）有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒；Ferments公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit反轉錄試劑盒；寶生物工程（大連）有限公司的SYBRPremixExTaq(TliRNaseHPlus)Ⅱ；其他生化試劑及耗材均為進口或國產(chǎn)分析純試劑；引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

恒溫培養(yǎng)箱（PGR15，COVVILN，加拿大）用于室內(nèi)處理橡膠樹幼苗，設定28℃培養(yǎng)箱處理對照材料，設定4℃培養(yǎng)箱低溫處理材料，其他條件設置為：相對濕度為80%，光照強度為125μmol/(m²·s)，16h光照和8h黑暗。

低溫脅迫的處理方法：將橡膠樹無性系‘93-114’和‘熱墾501’袋裝幼苗轉移至28℃恒溫培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)2d。然后把材料平均分為2組，以保留在28℃恒溫培養(yǎng)箱中的一組作為對照，轉移至4℃培養(yǎng)箱中的一組作為處理。在0、4、8、24h分別采集對照和處理的幼苗樹葉。每個時間段采集5株幼苗樹葉制成1個混合樣，共3次生物學重復。

干旱脅迫的處理方法：將‘93-114’袋裝苗在28℃預培養(yǎng)2d，然后平均分為2組，一組在28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，另一組除掉袋子和泥土，裸根置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、2、4、8、12、24h分別收集葉片，每個時間段采集5株幼苗葉片制成1個混合樣，3次生物學重復。

鹽脅迫處理方法：將‘93-114’袋裝苗在28℃預培養(yǎng)2d，然后平均分為2組，一組以400mmol/LNaCl溶液澆灌袋裝苗1次，另一組澆灌同樣體積的水，然后繼續(xù)置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別在0、2、4、8、12、24h6個時間段收集葉片，每個時間段采集5株幼苗葉片制成1個混合樣，3次生物學重復。所有采集的樣品都用于提取總RNA。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成

橡膠樹葉片總RNA的提取參照天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒的操作說明進行。cDNA第1鏈的合成根據(jù)Ferments公司試劑盒的操作步驟進行。

1.2.3 熒光實時定量PCR分析

采用Bio-Rad公司的CFX實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實驗操作按儀器使用說明書進行。合成的cDNA溶液稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析模板。反應體系10µL，包含模板1µL，2×SYBRPremix5µL和每條引物0.3µL，無菌水補足10µL。用于qPCR的Hsfs引物和內(nèi)參HbActin7a引物參照Li等的文獻。PCR反應程序為：95℃變性30s；95℃10s，60℃20s，72℃20s，共40個循環(huán)。40個循環(huán)后進行溶解曲線分析。利用CFXmanager3.0軟件自動進行基線和Cq值分析，算法為2–^△△Cq法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用T-test方法對基因表達水平進行差異顯著性分析（P＜0.01為極顯著差異）。

2 結果與分析

2.1 低溫對熱激轉錄因子基因表達的影響

依據(jù)橡膠樹幼苗耐寒性室內(nèi)評價鑒定體系，對30個橡膠樹Hsfs家族成員在低溫脅迫下‘93-114’和‘熱墾501’葉片中的表達模式進行了分析。在30個橡膠樹Hsf家族中，24個成員在‘93-114’葉片中的本底表達量顯著高于‘熱墾501’（圖1）。在低溫條件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b、HbHsfB1a和HbHsfB2b在橡膠樹‘93-114’和‘熱墾501’葉片中均呈顯著上調(diào)表達模式，其中HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114’葉片中的表達量顯著高于‘熱墾501’。C亞家族中的2個基因HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114’和‘熱墾501’葉片中的表達模式非常相似，對低溫脅迫比較敏感。在‘93-114’和‘熱墾501’葉片中均呈顯著下調(diào)表達的基因有HbHsfA3a、HbHsfA4b、HbHsfA5a、HbHsfB4c和HbHsfB4d五個基因，但是這些基因在‘93-114’葉片中的表達量顯著高于‘熱墾501’。另外，還有7個基因在‘熱墾501’中顯著上調(diào)表達，而在‘93-114’中呈顯著下調(diào)表達模式，其中HbHsfA7a和HbHsfB2c在‘93-114’中的轉錄水平依然高于‘熱墾501’（圖1）。

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