2.5 單水相催化體系的探索

據(jù)報(bào)道，反應(yīng)體系中添加助溶劑可能影響產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性。由于KpADH還原NBP0的e.e.值為97％，因此通過(guò)溶劑的優(yōu)化可能提高終產(chǎn)物的立體選擇性和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。作者針對(duì)單水相體系和水-有機(jī)兩相體系進(jìn)行了研究，根據(jù)不同底物濃度的研究結(jié)果，固定500mmol/L的底物濃度，保持底物與酶添加量的質(zhì)量比(S/C)為18.2:l的條件下，選擇不同的醇類助溶劑、有機(jī)溶劑以及綠色離子液體BMIN·PF6進(jìn)行體系的優(yōu)化。

如表2所示，反應(yīng)體系2、3、4中分別加入體積分?jǐn)?shù)5％醇類助溶劑，可以看出助溶劑雖然提高了反應(yīng)的初速率，但是反應(yīng)很快就在轉(zhuǎn)化率為60％左右時(shí)終止，這是產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的。反應(yīng)5中加入5％的乙酸丁酯，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.2％。由于乙酸丁酯的疏水性使得產(chǎn)物空間上與酶分離，因而轉(zhuǎn)化率得以提升，但也限制了酶與剩余底物的充分接觸，最終使得反應(yīng)在24h的轉(zhuǎn)化率未達(dá)到99％以上。少量有機(jī)溶劑的添加對(duì)e.e.值沒(méi)有影響。綜上，其中最佳的反應(yīng)體系為不加任何助溶劑的磷酸鹽緩沖液體系，在該體系中，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99％以上。

2.6 兩相催化體系的探索

采用水-有機(jī)溶劑的兩相體系可實(shí)現(xiàn)底物與酶、產(chǎn)物與酶在空間上的相對(duì)分離，從而避免酶失活。底物NBPO是疏水性底物，略微溶于水，不利于與酶分子充分接觸。此外，底物對(duì)酶分子有一定毒性，這也會(huì)導(dǎo)致酶分子的失活，因此嘗試兩相反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)油-水的界面反應(yīng)。作者選取了具有不同1gP值的10種有機(jī)溶劑進(jìn)行探究，分別測(cè)定了產(chǎn)物和底物在有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)以及有機(jī)溶劑對(duì)KpADH催化活性的影響，結(jié)果見(jiàn)表3-4。最終選擇產(chǎn)物分配系數(shù)分別為3.6和15.8以及殘余活力分別為91％和5％的有機(jī)溶劑：甲苯和乙酸丁酯。反應(yīng)體系6和7表明，50％有機(jī)溶劑的加入使e.e.值提高至98.9％。這表明酶在有機(jī)溶劑中剛性增強(qiáng)，構(gòu)象更加穩(wěn)定。但是，兩相反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化率均沒(méi)有達(dá)到99％的水平，且反應(yīng)速率較慢，說(shuō)明大量的底物溶解在有機(jī)溶劑中減少了酶與其碰撞的機(jī)會(huì),所以反應(yīng)速率下降，尤其是在反應(yīng)后期底物較少的情況下，無(wú)法與酶充分接觸，導(dǎo)致反應(yīng)不完全。

2.7 克級(jí)制備(S)-NBHP

從上述反應(yīng)體系優(yōu)化的結(jié)果可知，未加入任何助溶劑的反應(yīng)體系1可在24h內(nèi)催化還原500mmol/LNBP0，達(dá)到99.6％的轉(zhuǎn)化率，見(jiàn)圖4。說(shuō)明在該反應(yīng)過(guò)程中，底物NBP0逐漸溶解并完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(S)-NBHP，且產(chǎn)物難溶于水相體系，避免了與酶的大量接觸，未對(duì)酶活產(chǎn)生顯著影響。加入助溶劑后，反應(yīng)初速度加快，但增加了產(chǎn)物的溶解度，使之達(dá)到抑制濃度(459.9±118.6)mmol/L，所以反應(yīng)快速終止。另外，與兩相體系相比，大量有機(jī)溶劑的加入可以略微提高產(chǎn)物的e.e.值，但轉(zhuǎn)化不完全會(huì)影響終產(chǎn)物的純度。所以，不加任何助溶劑的磷酸鹽緩沖液體系更具備綠色、高效的生物催化制備條件。

因此。在反應(yīng)體系1的基礎(chǔ)上保持底物與酶添加量的質(zhì)量比(S/C)為18.2g/g不變，逐漸增加底物的質(zhì)量濃度至200g/L(1m01/L)，最終反應(yīng)12h，可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物的e.e.值為97％，產(chǎn)品收率為77％。與來(lái)源于釀酒酵母的羰基還原酶YDR541C催化合成(S)-NBHP相比，KpADH能夠在不加任何有機(jī)溶劑和外源輔酶的條件下實(shí)現(xiàn)較高濃度的轉(zhuǎn)化，表明腳ADH在酶法制備(S)-NBHP上具有良好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)語(yǔ)

作者篩選和比較發(fā)現(xiàn)勛ADH可以高效還原NBPO合成(S)-NBHP。通過(guò)反應(yīng)體系的探索，發(fā)現(xiàn)在加入乙醇等助溶劑的反應(yīng)體系中有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，且高濃度的產(chǎn)物NBHP對(duì)KpADH催化性能影響顯著。通過(guò)動(dòng)力學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，并計(jì)算獲得抑制常數(shù)Ki值為(459.92±118.59)mm01/L。反應(yīng)體系優(yōu)化的結(jié)果說(shuō)明，不添加任何助溶劑的體系能夠有效地避免產(chǎn)物抑制，同時(shí)也能使酶與底物充分接觸，反應(yīng)完全。在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了200g/L底物的完全轉(zhuǎn)化，克級(jí)制備獲得了(S)-NBHP。作者初步探究了NBHP對(duì)醇脫氫酶的抑制機(jī)制，并優(yōu)化和建立了解決抑制問(wèn)題的反應(yīng)體系，為實(shí)現(xiàn)(S)-NBHP的大規(guī)模酶法合成奠定了良好的研究基礎(chǔ)。

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