2 結(jié)果與討論

2.1 醇脫氫酶的篩選

對酶庫進(jìn)行有針對性的篩選是獲得新酶的有效途徑之一。分別以NADPH和NADH為輔酶，以N-Boc-3-哌啶酮(NBP0)為底物。在340nm對實(shí)驗(yàn)室保存的還原酶庫進(jìn)行高通量活力篩選。通過篩選發(fā)現(xiàn)，對NBP0具有還原活力的還原酶均為NADPH依賴型。進(jìn)一步對有活力的還原酶進(jìn)行立體選擇性分析，結(jié)果見表1。經(jīng)過活力的篩選得到6種對NBPO具有一定催化活力的還原酶，立體選擇性較高的有4種：KpADH、CgKRl、PAR、Cg26。其中Cg26的立體選擇性為尺構(gòu)型，其余3種為S構(gòu)型?？紤]到適用于大規(guī)模的酶法制備，一些商業(yè)參數(shù)指標(biāo)需要參考。例如生物催化劑載量，其決定反應(yīng)過程中酶制劑的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。較高的比活力有利于生物催化劑在較低的載量下實(shí)現(xiàn)底物濃度載量上的生物轉(zhuǎn)化數(shù),從而實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的生物催化過程。同時(shí)，前期工作中獲得了KpADH的晶體結(jié)構(gòu)并對KpADH的立體選擇性機(jī)制做了深入的分析，有利于后續(xù)的立體選擇性改造。從表1來看，KpADH較高的比活力在大規(guī)模的制備中更具有明顯的優(yōu)勢。所以，選取來自尉Kluyveromycespolyspora的KpADH為后續(xù)研究對象。

2.2 不同底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

具有應(yīng)用前景的生物催化反應(yīng)通常底物上載量應(yīng)大于100g/L，故首先考察了KpADH對高濃度NPB0的耐受情況。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NBPO為疏水性底物。因此,在10mL的反應(yīng)體系中加入5％的乙醇助溶，并加入相同的酶量(200U)考察不同底物濃度對反應(yīng)的影響。如圖1所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)化率快速趨于穩(wěn)定。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?50mmol/L時(shí)，反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，然而在底物濃度分別為500mmol/L和1mol/L時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化水平分別為390mmol/L和460mmol/L。底物濃度較高的兩個(gè)反應(yīng)都快速終止在400mmol/L的轉(zhuǎn)化水平,且延長反應(yīng)時(shí)間后轉(zhuǎn)化率并未得到改善。測定30℃KpADH的半衰期為80h，說明勛ADH的穩(wěn)定性良好。但在加入底物反應(yīng)1h左右,反應(yīng)快速終止在400mmol/L的轉(zhuǎn)化水平，說明反應(yīng)過程中較高的底物或產(chǎn)物濃度抑制了KpADH合成產(chǎn)物(S)-NBHP。該現(xiàn)象與之前報(bào)道的YDR541C在單水相催化中受到嚴(yán)重的抑制結(jié)果一致。說明可能是產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的。因此，作者考察不同濃度的產(chǎn)物對不對稱還原反應(yīng)的影響。
 

2.3 不同產(chǎn)物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

在1mL反應(yīng)體系中加入相同酶量(0.015U)、相同的底物濃度(50mmol/LNBPO)和不同的產(chǎn)物濃度(0-250mmol/LNBPH)?？疾觳煌a(chǎn)物濃度對KpADH催化還原NBPO反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖2。隨著產(chǎn)物濃度的增加，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸降低，直到反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近3％，說明產(chǎn)物抑制是影響NBP0轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

2.4 底物和產(chǎn)物抑制動(dòng)力學(xué)擬合分析

分別考察了不同濃度的底物和產(chǎn)物存在的條件下KpADH比活力的變化，并通過擬合獲得相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，見圖3。經(jīng)過底物動(dòng)力學(xué)測定，在高濃度底物的條件下KpADH的活力沒有明顯降低，K_m值為(17.4±1.1)mmol/L，V_max值為(88.3±2.2)μmol/(min·mg)，未發(fā)現(xiàn)明顯底物抑制的現(xiàn)象。在加入不同濃度的產(chǎn)物后，KpADH的比活力呈現(xiàn)不同程度降低，見圖3(b)的擬合曲線。通過抑制動(dòng)力學(xué)擬合分析和0rigin軟件評估擬合結(jié)果，非競爭抑制方程的擬合程度最高，R-Square值高達(dá)0.98(R-Square越接近1，說明擬合程度越高)。獲得抑制常數(shù)民值為(459.9±118.6)mmol/L，K_i值為(9.9±1.0)mmol/L，V_max-值為(83.9±2.9)μmol/(min·mg)。上述反應(yīng)體系中加入助溶劑乙醇以增加產(chǎn)物的水溶性,當(dāng)達(dá)到產(chǎn)物的抑制濃度后反應(yīng)受到抑制而進(jìn)入平臺期。

經(jīng)過擬合評估，該抑制類型屬于非競爭性抑制。這說明產(chǎn)物與酶的非活性部位相結(jié)合，形成產(chǎn)物和酶的絡(luò)合物后會進(jìn)一步再與底物結(jié)合：或者是酶與底物結(jié)合形成底物和酶絡(luò)合物后，部分再與產(chǎn)物結(jié)合。雖然底物、抑制物(產(chǎn)物)和酶的結(jié)合無競爭性，但兩者與酶結(jié)合所形成的中間絡(luò)合物不能釋放產(chǎn)物，導(dǎo)致了酶催化的表觀反應(yīng)速率降低。

據(jù)報(bào)道，NADPH依賴性的羰基還原酶YDR541C在單水相反應(yīng)體系中進(jìn)行NBP0(100～400mmol/L)的不對稱轉(zhuǎn)化，300mm01/L的NBP0可以在1h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，由于產(chǎn)物抑制作用，400mmol/L的NBPO轉(zhuǎn)化率僅為81.7％。最終反應(yīng)停留在300mmol/L的轉(zhuǎn)化水平。與還原酶PsCR一樣，在單水相體系中將4-氯-3-氧代丁酸乙酯(COBE)不對稱催化還原為(5)-4-氯-3-羥基丁酸酯(S)-CHBE)，當(dāng)產(chǎn)物濃度達(dá)到120mmol/L時(shí)，反應(yīng)速度急劇下降。作者通過動(dòng)力學(xué)擬合分析，當(dāng)達(dá)到抑制濃度400mmol/L時(shí)，產(chǎn)物與底物非競爭性地結(jié)合KpADH形成三元復(fù)合物，使KpADH構(gòu)象改變，不能進(jìn)一步釋放產(chǎn)物，導(dǎo)致酶活力下降。這種非競爭性抑制作用不能通過增加底物濃度來解除抑制。因此，在不同的底物濃度下硒ADH的轉(zhuǎn)化水平停留在400mmol/L。

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